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.2004年10月；24(20):9239-47.
doi:10.1128/MCB.24.20.9239-9247.2004。

睡眠美人转座酶N端DNA-结合域的突变分析：哺乳动物细胞中DNA结合和多动的关键残基

斯蒂芬·R·扬 1, 朱莉·帕克, 黄勇, 雅各布·吉姆·米克尔森, 马克·A·凯
附属公司

睡眠美人转座酶N端DNA-结合域的突变分析：哺乳动物细胞中DNA结合和多动的关键残基

斯蒂芬·R·扬等人。 分子细胞生物学. 2004年10月.

摘要

睡美人（SB）转座酶的N末端结构域介导脊椎动物细胞中的转座子DNA结合、亚单位多重聚合和核移位。在本报告中，我们通过大规模突变分析研究了这个多功能结构域中95个不同残基的相对贡献。我们发现四种氨基酸（亮氨酸25、精氨酸36、异亮氨酸42和甘氨酸59）中的每一种都有助于SB转座酶N端123氨基酸背景下的DNA结合，如电泳迁移率变化分析所示，并有助于全长转座酶的功能活性，通过定量HeLa细胞转座试验测定。此外，我们发现推定寡聚结构域（L11A、L18A、L25A和L32A）或核定位信号（K104A和R105A）内的氨基酸取代严重损害了其在哺乳动物细胞中介导DNA转位的能力。相反，二分DNA结合结构域内的10个单个氨基酸变化中的每一个都显示出极大地增强了哺乳动物细胞中SB的转座活性。这些过度活跃的突变在结合时起协同作用，并显示出显著提高转座子末端序列的转座酶亲和力。最后，我们表明，增强DNA结合活性可改善卵裂动力学，增加SB元素从宿主细胞染色体的动员，并显著提高SB在小鼠体内的基因转移能力。这些研究为脊椎动物转座子生物学提供了重要的见解，并表明《睡美人》可以很容易地进行改进，以增强哺乳动物的遗传研究应用。

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数字

图1。
图1。
氨基酸取代对蛋白质合成效率的影响某人人类细胞中的转座。（A） SB转座子原理图。图中显示了成对DNA结合域（PAI和RED）的两部分、GRRR AT钩基序、二分核定位信号和包含保守DD（35）E基序的催化核心。显示参与亚基多聚化的亮氨酸拉链（L-L-L-V）与PAI结构域重叠。（B） 通过质粒转染HeLa细胞表达SB10和代表性突变转座酶蛋白的免疫印迹分析。从转染后40 h的细胞中制备蛋白提取物，并进行电泳和电印迹，用SB蛋白的多克隆兔抗体检测40-kDa转座酶。（C） HeLa细胞中SB10和突变SB转座酶的相对转座活性。HeLa细胞与编码新肌球蛋白标记转座子（pT/nori）的质粒以及编码无转座酶（−）、标准SB10转座酶或转座酶错义突变的质粒共同转染。显示了95个丙氨酸扫描转座酶突变体相对于SB10的转座效率，调整为100%。三个独立实验后鉴定出的最佳多动突变体显示为黑柱。数字表示残基位置，星号表示亮氨酸拉链基序，方框包围AT钩基序和NLS的前两个残基。
图2。
图2。
单个氨基酸转座酶突变对转座子DNA结合活性的影响。（A） 对齐某人的DR序列，具有相同的核苷酸，以灰色阴影显示。（B） 来自SB10和突变转座酶的N123肽与编码外部DR（左栏）或内部DR（右栏）序列的双链放射性标记寡核苷酸络合。数字代表SB10中突变为丙氨酸的氨基酸残基。缩写：−，无转座子控制；SB公司+，SB10-DNA复合物是在500倍未标记寡核苷酸作为特定竞争物存在的情况下形成的。
图3。
图3。
对频率的影响某人在结合使用超活性突变和存在超活性转座子的情况下使用元件转座。（A） 第一代（pT/nori）和超活性（pT3/nori）新粘蛋白标记转座子载体的示意图概述。pT3衍生的载体通过复制左侧IR-DR结构包含一个额外的转座增强子结构域，并在元件的3′端侧翼有一个额外的TA二核苷酸（下划线），以促进更多的切除。（B） 使用传统SB10/pT和过度活跃的转座酶和转座子成分的HeLa细胞中的转座频率。与SB10转座酶相比，组合中过度活跃突变的影响更明显。图中显示了与pT/nori（白色条）或pT3/nori（阴影条）结合使用的每个转座酶的基因转移频率。
图4。
图4。
转座子结合位点SB10和HSB突变体相对结合亲和力的比较。用于SB10和高活性转座酶的SB-N123肽与编码内部（A）或外部（B）DR序列的双链放射性标记寡核苷酸络合。蛋白质-DNA复合物是在相应的未标记寡核苷酸数量增加的情况下形成的。使用磷光成像仪测定结合百分比，并根据在没有任何竞争对手的情况下结合的探针数量减去500 nM浓度下结合的探头数量进行归一化。
图5：。
图5：。
氨基酸取代对人体细胞中供体DNA切割活性的影响。转座子供体质粒单独或与转座酶质粒联合瞬时转染HeLa细胞，30小时后分离DNA，用供体元件两侧的引物进行PCR分析。已经历的供体质粒某人-介导的转座子切除和双链断裂支持271-bp产物的扩增。金额某人在非活动（车道3-5）和过度活动（车道6-8）的情况下产生的元素切除某人突变体显示为相对于SB10存在下产生的突变体。
图6。
图6。
转座酶过度活性对染色体转座率的影响。（A） 检测罕见染色体转座事件的遗传分析。一个新霉素抗性基因(新)在猴病毒40（SV40）的控制下，通过插入一个非自主的启动子使其失活某人含有潮霉素抗性（hyg）的元素R（右）)由胸苷激酶（TK）启动子驱动的基因。该结构被包装成慢病毒，并作为单拷贝前病毒随机整合到受感染HeLa细胞的基因组中。活性SB转座酶在这些细胞中的瞬时表达导致某人元素和激活的表达式新基因，导致G418耐药生长。LTR，人类免疫缺陷病毒1型长末端重复序列；chrm，染色体。（B） 使用SB10和超活性转座酶测定HeLa细胞的转座频率。将三种不同的报告细胞系分别瞬时转染编码绿色荧光蛋白（GFP）的质粒SB10或HSB3作为对照。在G418中选择细胞生长3周，并固定、染色和计数产生的菌落。ND，未检测到。
图7。
图7。
标准pT/SB10与高活性pT/SB1给药后小鼠肝脏转座活性的比较某人系统。C57BL/6型-科学情报部将1μg编码无转座酶、SB10或改良转座酶（HSB2）的质粒以及25μg pT/βgeo（编码β-半乳糖苷酶标记的转座子）或改良pT3/βgeo版本通过尾静脉注射给小鼠（每组4-5只）。6周后处死小鼠，对其肝脏进行切片和β-半乳糖苷酶染色，以测定X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d日-在每个实验条件下观察到吡喃半乳糖苷阳性肝细胞（显示±标准偏差）。SB10转座酶和pT/βgeo的转座效率调整为100%，其他组合显示为相对活性。在每一条横线的上方记录的是6周后仍保持X-Gal阳性的转染小鼠肝细胞的百分比。
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    1. 比尔·E·L、M·B·马奥尼和D·C·里奥，2002年。果蝇P-元件转座酶超活性突变型的鉴定和分析。遗传学162:217-227。-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Colloms，S.D.，H.G.van Luenen和R.H.Plasterk，1994年。秀丽隐杆线虫Tc3转座酶的DNA结合活性。核酸研究22:5548-5554。-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Cui，Z.、A.M.Geurts、G.Liu、C.D.Kaufman和P.B.Hackett。2002.睡眠美人转座子倒置末端重复序列的结构-功能分析。分子生物学杂志。318:1221-1235.-公共医学
    1. Drabek，D.、L.Zagoraiou、T.deWit、A.Langeveld、C.Roumpaki、C.Mamalaki、C.Savakis和F.Grosveld。2003年。小鼠生殖系中果蝇转座子的转座。基因组学81:108-111。-公共医学

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