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.2004年10月13日；23(20):4051-60.
doi:10.1038/sj.emboj.7600385。 Epub 2004年9月16日。

微RNA基因由RNA聚合酶II转录

李约泰 1, 金敏菊, 韩金菊, Kyu-Hyun Yeom先生, 桑赫·李, 宋熙白, V纳瑞·金
附属机构

微RNA基因由RNA聚合酶II转录

Yoontae Lee公司等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

微RNA（MicroRNAs，miRNAs）是一大家族非编码RNA，在多种基因沉默途径中起导向分子的作用。目前的研究主要集中在miRNAs的调控功能上，而对于这些异常基因本身是如何调控的，人们知之甚少。在这里，我们首次提出了miRNA基因由RNA聚合酶II（pol II）转录的直接证据。初级miRNA转录物（pri-miRNA）包含帽状结构和聚（A）尾，这是II类基因转录物的独特特性。在选择性抑制pol II活性的浓度下，用α-α-甘氨酸处理人类细胞可降低pri-miRNAs的水平。此外，染色质免疫沉淀分析表明pol II与miRNA启动子有物理关联。我们还首次通过测定mir-23a约27a约24-2的启动子和终止子来描述miRNA基因的详细结构。这些数据表明，pol II是miRNA基因转录的主要（如果不是唯一的）RNA聚合酶。我们的研究为理解miRNA基因的结构和调控提供了基础。

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数字

图1
图1
Pri-miRNAs含有5′帽结构。(A类)用RPA亲和纯化含帽RNA。使用来自HeLa细胞的总RNA，使用帽结合蛋白eIF4E进行选择性富集。从结合的（B）或未结合的（UB）级分中提取RNA。由于每个部分的整个RNA用于分析而没有进一步的标准化，因此它对应于100%的输入。(B类)RT-PCR证明cap不仅存在于pri-miR-23a中∼第27页∼24-2，但也适用于pri-let-7a-1、pri-let-3a、pri-miR-30a、pri-miR-21、pri-mi-17∼18∼19个∼20∼19b-1和pri-miR-15a∼16-1. GAPDH前mRNA、45S前rRNA和前tRNA提尔用作对照。从每个级分（100%结合的（B）或100%未结合的（UB）级分）提取的整个RNA用于测定。
图2
图2
Pri-miRNAs是多聚腺苷化的。(A类)使用寡聚-dT纤维素从HeLa总RNA中选择性富集聚腺苷化RNA，然后使用RPA。从结合的（B）或未结合的（UB）级分中提取RNA。由于来自这些组分的整个RNA用于分析而没有进一步的标准化，因此它对应于100%的输入。(B类)RT-PCR显示聚（A）尾不仅存在于pri-miR-23a中∼第27页∼24-2，但也适用于pri-let-7a-1、pri-let-3a、pri-miR-30a、pri-miR-21、pri-mi-17∼18∼19个∼20∼19b-1和pri-miR-15a∼16-1. GAPDH前mRNA、45S前rRNA和前tRNA提尔用作对照。从每个部分（100%结合（B）或100%未结合（UB）部分）提取的整个RNA用于分析。
图3
图3
miRNA基因的转录对α-amanitin敏感。用浓度为0或50μg/ml的α-amanitin处理HeLa细胞9小时。从这些细胞中制备总RNA，并在20μl反应中合成5μg总RNA。使用基因特异性引物通过RT-PCR测定pri-miRNAs的水平。从未经处理的细胞（1-3道）中提取不同数量（0.5、1或2μl）的cDNA模板用于PCR，以查看PCR扩增是否在定量范围内。GAPDH前mRNA、45S前rRNA和前tRNA提尔用作对照。
图4
图4
miRNA基因簇miR-23a的5′端结构∼第27页∼24-2. (A类)miR-23a转录起始位点周围的序列∼第27页∼24-2基因。指示了与用于引物延伸（PE23B）的引物结合的序列。填充箭头表示由引物延伸决定的主要转录起始位点，而空箭头表示次要起始位点。(B类)引物延伸分析以确定转录起始位点。只有在用抗Drosha的siRNA处理细胞后（+siDrosha，第5车道），才能检测到延伸产物。(C类)报告器结构示意图。相对于转录起始位点，范围从−603到+36 bp的片段位于荧光素酶基因（pGL3-23P639）的上游。(D类)对共转染的萤火虫荧光素酶进行归一化后，显示其相对活性雷尼利亚荧光素酶活性（内部控制）。pGL3-basic是用作产生pGL3-23P639的骨架的无启动子构建体。(E类)底漆延伸分析。报告结构（pGL3-23P639）的转录起始位点与内源性miR-23a的转录起始点相同∼第27页∼24-2基因。注意，用于延伸的引物（PXT-luc）是荧光素酶mRNA的补充。
图5
图5
分析mir-23a～27a～24-2基因启动子。(A类)报告器结构示意图。启动子的5′端（X）在−2010到+1之间变化，而3′端对应于相对于转录起始位点的+36，如图4所示。(B类)报告体表达的荧光素酶的相对活性。质粒与雷尼利亚荧光素酶构建入HEK293T细胞，转染48小时后进行酶活性测定。萤火虫荧光素酶的相对活性根据雷尼利亚荧光素酶活性。
图6
图6
的转录mir-23a～27a～24-2基因簇依赖于pol II。(A类)使用报告质粒pGL3-23P639或pRL-CMV进行萤光素酶测定。用报告质粒转染HEK293T细胞。在添加质粒后，将细胞在0或50μg/mlα-amanitin中培养6小时，然后采集细胞进行检测。(B类)RT-PCR显示在这种情况下pol II活性（GAPDH前体mRNA）选择性降低，而pol III活性（前体tRNA提尔)不受影响。
图7
图7
RNA pol II与mir-23a～27a～24-2基因。(A类)启动子区域的序列。箭头表示PCR所用的引物序列。”+1’代表主要转录起始位点。(B类)显示了HeLa细胞培养物的ChIP分析。用针对最大RNAP II亚单位RPB1的C末端结构域的单克隆抗体（抗pol II；8WG16）或针对磷酸化形式的RPB1的单克隆抗体（抗pol II-P；H5）进行ChIP分析。正常小鼠血清（免疫前）也用作阴性对照。用miR-23a启动子区域两侧的引物对PCR分析染色质免疫沉淀物∼第27页∼24-2，45S rRNA启动子或tRNA提尔基因。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行解析，通过溴化乙锭染色显示，并呈现为反向图像。
图8
图8
miRNA基因簇的3′末端结构mir-23a～27a～24-2. (A类)pri-miR-23a的示意图∼第27页∼24-2. 在成熟miR-24-2的3′端下游+1751 bp处发现一个推测的多聚腺苷酸化信号（AAUAAA）。从数据库搜索中，我们发现一个mRNA（AL832183），包含成熟miR-24-2右下游的序列（相对于miR-24-23′端从+1到+1771）。(B类)AL832183似乎是Drosha介导加工的副产品，因为Drosha在miR-24-2的3′端裂解，生成与AL832188完全相同的5′端。Drosha产生的解理位点用箭头表示。(C类)如（A）所示，使用三种不同的反向引物结合到假定的多聚腺苷酸化位点附近的序列进行RT-PCR。乐队∼当使用反向引物A时，可以清楚地检测到2.2 kb。请注意，只有当转染针对Drosha（siDrosha）的siRNA耗尽Drosha时，才能看到该信号（1–3道）。基因组DNA被用作泳道7-9中的模板，以鉴定PCR引物对。
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