A conserved protein network controls assembly of the outer kinetochore and its ability to sustain tension

doi:10.1101/gad.1234104

.2004年9月15日；18(18):2255-68.

doi:10.1101/gad.1234104。

一个保守的蛋白质网络控制着外动粒的组装及其维持张力的能力

Iain M Cheeseman先生¹, 雪利·尼森, 斯科特·安德森, 弗朗西·亨德曼, 约翰·耶茨（John R Yates）第三, 凯伦·欧格玛, 阿尔沙德·德赛

附属公司

PMID： 15371340
预防性维修识别码：第517519页
DOI（操作界面）： 10.1101/gad.1234104

一个保守的蛋白质网络控制着外动粒的组装及其维持张力的能力

Iain M Cheeseman先生等。基因开发. 2004.

.2004年9月15日；18(18):2255-68.

doi:10.10101/gad.1234104。

作者

Iain M Cheeseman先生¹, 雪利·尼森, 斯科特·安德森, 弗朗西·亨德曼, 约翰·耶茨（John R Yates）第三, 凯伦·欧格玛, 阿尔沙德·德赛

附属

¹路德维希癌症研究所，美国加利福尼亚州拉霍亚，邮编：92093。ichesesman@ucsd.edu公司

PMID： 15371340
预防性维修识别码： PMC517519
DOI（操作界面）： 10.1101/gad.1234104

摘要

动粒通过与纺锤体微管形成动态连接，在染色体分离中发挥重要作用。在这里，我们从秀丽隐杆线虫中鉴定了一组10种共纯化动粒蛋白，其中7种之前未经鉴定。利用体内分析来监测染色体分离、动粒组装和染色质-微管连接的机械稳定性，我们表明这种铜化蛋白网络在动粒-微管界面起着核心作用。此外，我们的分析表明，该网络由三组以不同方式参与该界面的蛋白质组成：KNL蛋白质在着丝粒染色质组装后起作用，生成微管结合界面的核心，MIS蛋白质控制该界面的形成速度和程度，和NDC蛋白是在与纺锤形微管相互作用期间维持张力所必需的。我们还从人类细胞中纯化了一组类似的相关蛋白，其中包括四种新蛋白，并且每个功能类别都有可识别的同源物。因此，该蛋白质网络是外动粒的保守组成部分，我们对秀丽线虫的分析所确定的功能可能具有广泛的相关性。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
KNL-3是一种动粒蛋白，其缺失导致动粒无表型。(A类)KNL-3-和KNL-1缺失的胚胎表现出类似的染色体分离缺陷。显示了从野生型、KNL-3缺失和KNL-1缺失胚胎的延时序列中选择的图像。胚胎来源于一株共表达GFP-组蛋白H2B以标记染色体（箭头）和GFP-γ-微管蛋白以可视化纺锤体极（箭头）的菌株。核膜破裂（NEBD）后的时间（以秒为单位）显示在下右每个面板的。在18个KNL-3缺失胚胎中观察到相同的表型。(B)KNL-3-和KNL-1缺失的胚胎在数量上表现出相同的早期纺锤极分离。绘制了野生型纺锤极分离动力学(n个=15），KNL-3完成(n个=18），且KNL-1耗尽(n个=14）胚胎。所有序列都相对于NEBD（0秒）进行时间对准，并计算每个时间点的平均主轴极间距。误差条表示S.E.M.，置信区间为0.95。(C类)KNL-3在有丝分裂过程中定位于动粒。(左侧柱）使用亲和纯化抗体获得的免疫荧光图像。微管显示为绿色，DNA显示为蓝色，KNL-3显示为红色(赖特列）从稳定表达GFP-KNL-3的胚胎的延时序列中选择的图像。(D类)来自CENP-C下游的KNL-3功能^HCP-4型在动粒组装层次中。直接标记的亲和纯化抗体用于分析KNL-3和CENP-C^HCP-4型在野生型、KNL-3缺失型和CENP-C中的定位^HCP-4型-耗尽的胚胎。棒材，10μm。

**图2。**
从蠕虫提取物中纯化KNL-1和KNL-3相互作用蛋白。(A类)从蠕虫提取物中分离的蛋白质在14%聚丙烯酰胺凝胶上进行分级，并通过银染色进行可视化。(左侧小组）带有GST抗体（作为对照）、KNL-1或KNL-3的免疫沉淀。(赖特面板）MIS-12和KBP-1的LAP标签净化。(B)描述定位和亲和纯化（LAP）标签和串联亲和纯化方案的图表。(C类)纯化物的质谱分析A类表示所示蛋白质获得的序列覆盖率百分比。在此分析中，对整个洗脱液进行了分析（非特定谱带）。KNL-1、KNL-3和CENP-C^HCP-4型由于8-M尿素洗脱不能有效分离抗体-抗原复合物，因此在相应的免疫沉淀物中或弱存在或缺失（用⋆表示）。因此，使用更严格的二次洗脱和Western blotting证实了它们的存在（数据未显示；另见Desai等人2003）。对于IP，仅列出KNL-1和KNL-3 IP中存在的蛋白质，但不列出对照中的蛋白质。指出了每种蛋白质的预测分子量以及其耗竭对胚胎生存能力的影响。EMB指>95%的胚胎致死率，而WT指对胚胎存活率无影响。

**图3。**
新的KNL-1/3相互作用蛋白定位于动粒。(A类)免疫荧光显示内源性KBP-1、KBP-2、Spc25的定位^KBP-3型以及使用亲和纯化抗体将KBP-4与动粒结合。微管显示为绿色，DNA显示为蓝色。RNAi后的类似阶段胚胎被证明观察到的定位是特异性的。(B)静态图像显示MIS-12、KBP-1、Spc25的LAP-标记（GFP）融合蛋白的定位^KBP-3型中期，KBP-4和KBP-5。棒材，10μm。

**图4。**
人类细胞具有相互作用的蛋白质网络，类似于在*秀丽线虫*. (A类)KNL-1、真菌Spc105p和人类AF15q14之间的相似性。的示意图*酿酒酵母*Spc105p，*葡萄裂殖酵母*Spc105p，*秀丽线虫*KNL-1和人类AF15q14蛋白，突出了不变的N末端[S/G]ILK和RRSVF基序、N末端MELT重复和C末端卷曲-线圈结构域。蛋白质序列中的位置显示为总长度的百分比。使用非冗余数据库的种子顶部搜索（NCBI），以三个退化MELT重复序列作为输入，识别AF15q14。两者之间有17.8%的一致性和36.4%的相似性*S.pombe公司*Spc105p与人AF15q14的同源性为17.2%，相似性为45.7%*秀丽线虫*KNL-1和人AF15q14。(B)在来源于HeLa细胞的稳定克隆细胞系中LAP-hMis12定位于动粒。棒材，10μm。(C类)从HeLa细胞纯化LAP-hMis12分离出多种相互作用蛋白。蛋白质在13.5%聚丙烯酰胺凝胶上分离，并通过银染色进行可视化。(D类)净化的质谱分析如所示C类表示覆盖率大于5%的每个多肽的序列覆盖率。样品中存在的热休克蛋白和几种形式的角蛋白未列出。(E类)瞬时表达YFP融合物到hMis12纯化中鉴定的新蛋白的T98G人组织培养细胞的成像。点状病灶的定位表明它们在中期和后期定位于动粒。插入显示了代表姐妹动粒的成对圆点的放大图像。棒材，10μm。

**图5。**
KNL-1和KNL-3相互作用蛋白的耗竭导致明显的染色体分离缺陷。(A类)特殊用途25^KBP-3型缺失导致类似于NDC-80和Nuf2缺失的表型^HIM-10型.野生型胚胎或NDC-80或Spc25缺失的胚胎表达GFP-组蛋白H2B和GFP-γ-微管蛋白的延时电影的静止图像^KBP-3型所指示的时间是相对于NEBD的。(B)NDC-80-和Spc25^KBP-3型-耗尽的胚胎表现出类似的早期纺锤极分离。该图显示了野生型纺锤极分离动力学(n个=15），NDC-80耗尽(n个=12）和Spc25^KBP-3型-耗尽(n个=8）胚胎。根据NEBD（0秒）对所有序列进行时间校准，并计算每个时间点的平均纺锤极间距。误差条表示S.E.M.，置信区间为0.95。(C类)MIS-12、KBP-1、KBP-2和KBP-4的缺失会导致染色体分离缺陷。显示了典型延时电影的静态图像。箭头表示姐妹染色单体分辨率较差。箭头表示后期染色体团过早圆整。上斜体数字*左上角*NEBD后，每个面板的秒数。上的数字下右是相对于可见染色体分离的时间（以秒为单位）。棒材，10μm。

**图6。**
MIS蛋白的耗竭导致独特的纺锤体“反弹”表型。(A类)使用一种算法处理表达GFP-组蛋白H2B和GFP-γ-微管蛋白的胚胎的延时电影中的静态图像，以修复*X（X）*-*Y（Y）*电影中一个主轴极（红色箭头）的坐标，并旋转每个帧，使第二个主轴极位于同一位置*Y（Y）*-坐标。从每一帧上切下一条12像素宽的矩形条带，包括两个纺锤杆，并垂直蒙太奇，以生成一个kymograph。在NEBD启动了波形图，连续条带之间的时间间隔为10秒。在波形图中，可以看到纺锤极（箭头）和染色体（箭头）的分离。棒材，10μm。(B)显示15个MIS-12缺失胚胎纺锤极分离痕迹的图表，与可见染色体分离的开始时间一致。(C类)绘制野生型平均主轴极间距与时间的关系图(n个=15），KNL-3耗尽(n个=18），MIS-12已完成(n个=16），KBP-1已完成(n个=11），KBP-2完成(n个=20），且KBP-4已完成(n个=10）相对于可见染色体分离的开始排列的胚胎。MIS-12-、KBP-1-和KBP-2-缺失胚胎的动力学曲线几乎无法区分。由于KNL-3缺失胚胎中没有染色体分离，因此对KNL-3痕迹进行了比对，以保持与图1所示野生型痕迹的相同关系。平均最大伸长率为4.6μm/minmis-12（RNAi）; 5.7μm/minkbp-1（RNAi）; 5.0μm/minkbp-2（RNAi）; 5.4μm/minknl-3（RNAi）; 5.4μm/minndc-80（RNAi）; 野生型前中期纺锤伸长率为2.5μm/min。误差条表示S.E.M.，置信区间为0.95。

**图7。**
MIS蛋白控制外着丝粒组装的速率和范围。(A类)KBP-2的耗尽导致KNL-3定位的严重但可变的缺陷。微管显示为绿色，DNA显示为蓝色左边.两个*kbp-2（RNAi）*胚胎显示了KNL-3定位的可变性。在这两种情况下，KNL-3定位相对于野生型显著降低。在底部胚胎中，可检测到更多KNL-3。所有图像均被同等采集和处理。(B)MIS-12的耗尽降低了KNL-3的定位，但不影响CENP-C^HCP-4型免疫荧光图像显示KNL-3和CENP-C的定位^HCP-4型在野生型和MIS-12缺失胚胎中。(C类)实时成像表明，MIS蛋白的缺失导致KNL-3和Spc25动粒靶向性的延迟和减少^KBP-3型从表达GFP-KNL-3的野生型和KBP-1缺失胚胎的延时序列中选择的图像(顶部两行）或GFP-Spc25^KBP-3型(底部两排）。所示时间为可见染色体分离开始前几分钟。棒材，10μm。

**图8。**
KNL、MIS和NDC蛋白在动粒组装的分子层次中的位置。(A类)KNL-3在KNL-1上游运行。免疫荧光图像显示KNL-3和KNL-1在野生型、KNL-3缺失和KNL-1-缺失胚胎中的定位。微管显示为绿色，DNA显示为蓝色左边.巴，10μm。(B)延时序列的静态图像显示了选定动粒标记的定位（标记在顶部（每列的）在缺乏所示动粒成分的胚胎中（标记为左边每行）。棒材，10μm。(C类)本地化依赖项摘要。使用亲和纯化抗体的免疫荧光和GFP融合的活细胞分析来检查定位依赖性，如A类和BKNL-1和NDC-80的一些数据来自Desai等人（2003年）。每个组合检查5到10个胚胎。(D类)图表总结了*秀丽线虫*动粒蛋白。(E类)包含中总结的依赖关系数据的摘要模型D类以及为KNL、MIS和NDC蛋白质组定义的功能。

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