Role of the fission yeast SUMO E3 ligase Pli1p in centromere and telomere maintenance

doi:10.1038/sj.emboj.7600394

.2004年10月1日；23(19):3844-53.

doi:10.1038/sj.emboj.7600394。 Epub 2004年9月9日。

分裂酵母SUMO E3连接酶Pli1p在着丝粒和端粒维持中的作用

布莱塔·希梅尔塞¹, 雅各布·西勒, Genevive Thon公司, 安妮·德让, 大血管贝诺

附属公司

PMID： 15359282
预防性维修识别码： PMC522793型
内政部： 10.1038/sj.emboj.7600394

分裂酵母SUMO E3连接酶Pli1p在着丝粒和端粒维持中的作用

布莱塔·希梅尔塞等。欧洲工商管理硕士J. 2004.

.2004年10月1日；23(19):3844-53.

doi:10.1038/sj.emboj.7600394。 Epub 2004年9月9日。

作者

布莱塔·希梅尔塞¹, 雅各布·席勒, Genevive Thon公司, 安妮·德让, 大血管贝诺

附属

¹法国巴黎塞德克斯巴斯德研究所Glenome动力单元。

PMID： 15359282
预防性维修识别码： PMC522793型
内政部： 10.1038/平方英尺/平方英尺.7600394

摘要

氨酰化反应是翻译后蛋白质修饰的一种保守机制。我们报告称，Pli1p是SP-RING家族中唯一的裂变酵母成员，在体内和体外均为SUMO E3连接酶。pli1Delta细胞没有明显的有丝分裂生长缺陷，但对微管建立药物TBZ敏感，并表现出增强的微染色体丢失。pli1Delta细胞着丝粒功能减弱可能与中心核异染色质结构缺陷有关，如插入cnt和imr的一个ura4杂色报告基因沉默减少所示。有趣的是，pli1Delta细胞在这些位点上也表现出更多的ura4报告子丢失，可能是通过使用同源序列作为信息供体进行基因转换。此外，pli1Delta细胞的端粒长度持续增加，可能是通过类似的过程实现的。Pli1p环指内的点突变完全或部分复制了pli1缺失表型，因此与其sumoylation活性相关。总之，这些结果强烈表明，Pli1p和延伸的sumoylation参与了调节特定异色重复序列中重组的机制。

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数字

图1
Pli1p的SAP和SP-RING结构域以及几种（推定的）SP-RING SUMO连接酶的序列比对。对齐*S.pombe公司*第1页，*酿酒酵母*Siz2p、Siz1p、，*D.黑腹果蝇*Zimp-B和智人hPIASy蛋白序列（GenBank登录号分别为CAA22599.1、NP_014799、NP_010697、AAD29288、Q8N2W9），使用CLUSTAL X算法。将相同的残留物装箱，并对类似残留物进行遮盖。Pli1p与其他四个直系同源序列的总序列同源性为26–27%（33–38%相似性），而SAP域具有22–35%的相同残基（75–68%类似性），SP-RING域具有39–51%（70–75%相似性）。星号表示形成C2HC3保守SP-RING结构域的半胱氨酸和组氨酸残基的位置。

图2
Pli1p定位于细胞核并形成许多病灶。(A类)WT（PB46）和*pli1-CFP公司*（BX4）细胞呈指数增长至5×10⁶用多聚甲醛固定MM细胞，用抗CFP兔多克隆抗体染色，然后用FITC-偶联抗兔IgG二级抗体和DAPI染色。每0.4μm对细胞进行Z扫描显示*CFP公司*-观察到的特定斑点*pli1-CFP公司*细胞核内到处可见细胞。(B类)WT变性蛋白全细胞提取物（PB46）和*pli1-CFP公司*（BX4）细胞在上述相同条件下生长。

图3
Pli1p促进SUMO结合体内和*在体外*. (A类)WT的全细胞提取物，*pli1C321S型*和*第1页*在变性8%（顶面）和15%（中面）SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离Δ细胞，并用抗Pmt3p抗血清进行Western印迹。抗Pmt3p多克隆抗体所揭示的条带的特异性通过其在伊斯₆*-pmt3（pmt3）*携带内源性pmt3基因的菌株在框架中与氨基末端His6标签融合。箭头表示未共轭的Pmt3p；星号表示交叉反应带。所用菌株：PB46（WT）；BX6（pli1C321S）；BX2（Δ*第1页*); BX5型(他的₆*-pmt3（pmt3）*). (B类)氨酰化反应*在体外*-翻译，³⁵S-标记的Rad22p底物（每反应4μl，总计22μl）和重组、细菌产生的Pmt3p（Pmt3-GG，2-7道1μg）、E1（GST-Rad31p-Fub2p，32 ng）、E2（Hus5p，1-2道和4-7道80 ng；3道400 ng）和WT或Pli1C321S（分别为4.8、24、120、4-7道600 ng）蛋白质。改性物种（即单改性Rad22）的最快迁移带通过磷成像仪分析进行量化，并表示为总Rad22p的百分比。(C类)Rad22p的反应时间历程*在体外*修改。标准反应（4μl³⁵组装S-Rad22p、1μg Pmt3-GG、32 ng E1、80 ng E2），包含8 ng WT Pli1p（方形开口）、Pli1pC321S（三角形开口）或Pli1bC321S/H323A/C326S（圆形开口），并培养指定时间。开放式和封闭式钻石代表分别在80和400 ng E2（Hus5p）下未添加E3的改性。通过荧光成像仪分析量化总修饰百分比。

图4
的影响*第1页*着丝粒功能突变体。(A类)*第1页*细胞对微管稳定药物噻菌灵（TBZ）敏感：连续五倍稀释的WT指数培养物（PB10），*pli1C321S型*（BX7）和*第1页*在含有TBZ（17.5或20μg/ml）的YES和YES板上发现Δ（BX1）细胞，并在33°C下培养4天。(B类)*第1页*细胞显示微小染色体丢失的频率增加。WT的独立菌落（JS161），*第1页*C321S（BX9）和*第1页*在腺嘌呤选择性培养基中生长的Δ（BX8）菌株，为了选择是否存在Ch16微染色体，以10的浓度被镀到YE板上^三细胞/平板，在33°C下培养4天。所示值是两个独立实验中16个独立菌落的红菌落百分比的平均值。(**C、 D类**)*第1页*缺失影响着丝粒中央核的沉默。的表达式*尿酸4*⁺插入着丝粒1的三个不同位置的基因，如（C）所示，通过连续三倍的电镀效率进行测定(*碳纳米管*)或五倍(*国际货币兑换*和*otr系统*)选择性培养基上发现的细胞悬浮液稀释液如（D）所示。使用的菌株：*cnt1TM1（Nco*一） ●*尿酸4*⁺：重量=336财年，*pli1C321S型*=BX10，*第1页*Δ=PG2964；*imr1R（Nco*一） ●*尿酸4*⁺：重量=FY498，*pli1C321S型*=BX12，*第1页*Δ=PG2972；*otr1R（转速*一） ●*尿酸4*⁺：重量=FY648，*pli1C321S型*=BX14，*第1页*Δ=PG2976。

图5
的影响*第1页*关于稳定性的删除*尿酸4*⁺基因插入于*国际货币兑换率*. (A类)着丝粒1中央结构域的结构*欧洲标准化委员会1*+以及*CEN1：imr1R（Nco*一） ●*尿酸4*⁺菌株*.Kpn（千磅）*我和*Nco公司*指示了I位点、其各自消化片段的大小以及用于Southern blot分析的探针的位置。请注意*碳纳米管1*和*尿酸4*探针还分别识别同源序列*欧洲标准化委员会3*和*乌拉4D/SE*基因座，从而起到内部控制的作用。(B类)稳定[ura−]独立克隆的Southern blot分析*CEN1-imr1R（Nco*一） ●*尿酸4*已为删除*第1页*基因。消化后千磅一、在琼脂糖塞中制备的基因组DNA在1.2%琼脂糖凝胶上进行脉冲场电泳，并使用Southern Blot分析*碳纳米管1*探查。然后剥离膜并用*尿酸4*探查。基因组DNA也用*Nco公司*一、在0.75%琼脂糖凝胶上进行电泳，转移到尼龙膜上并与*国际货币1*探查。显示了条带的大小或特性。使用的菌株：*欧洲标准化委员会1*⁺：PB10；*欧洲标准化委员会1*-*imr1R（Nco*一） ●*尿酸4*⁺：重量=FY498，*第1页*Δ=PG2972；从PG2972菌株BX13_1–20中分离出20个[ura−]独立克隆。

图6
遗传相互作用*第1页*重组基因：对端粒长度的影响。(A类)遗传相互作用*第1页*具有同源重组突变体。来自二倍体杂合子的三个代表性四分体用于破坏*第1页*或者*拉德50*（BX16），*放射性22*（BX18）或*雷达51*（BX19），以及来自rad51（JAC1/51Δ）×*pli1C321S型*（BX7）十字，如图所示。通过在适当的选择性培养基上进行复制平板和/或PCR，确定（或推断）每个分离物的基因型；钻石表示双突变体克隆。鉴于*放射性22*和*第1页*位点（0.05 Morgans），四分体分析*放射性22*+/−*第1页*+/−二倍体（250个四分体）由广泛的随机孢子分析补充（数据未显示）。(B类)（1）WT（PB10）端粒长度的Southern blot分析；（2）*pli1C321S型*（BX7）；（3）*第1页*Δ（BX1）；(4)*第1页*Δ/*拉德50*Δ（BX20）；(5)*拉德50*Δ（BX21）；(6)*pli1C321S/rad51*Δ（BX22_1）；(7)*雷达51*Δ（BX22_2）；(8)*pli1C321S型*Δ（BX22_3）；（9）重量（BX22_4）。BX22_1–4对应于rad51（JAC1/51Δ）×*pli1C321S型*（BX7）十字架。用消化后生态RI，基因组DNA在1%琼脂糖凝胶上进行电泳，转移到尼龙膜上，并与端粒DNA探针杂交（Cooper等, 1997).

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