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比较研究
.2004年9月1日；18(17):2095-107.
doi:10.1101/gad.1204904。 Epub 2004年8月16日。

缺氧和细胞凋亡缺陷导致基因组不稳定和肿瘤发生

迪尔德丽·纳尔逊 1, 婷婷潭, 阿诺德·拉布森, 戴安娜·安德森, 库尔特·德根哈特, 艾琳·怀特
附属公司
比较研究

缺氧和细胞凋亡缺陷导致基因组不稳定和肿瘤发生

迪尔德雷·纳尔逊等。 基因开发. .

摘要

基因组不稳定性是癌症发展和进展的一个标志，表征产生的压力以及细胞对基因组扰动的反应机制至关重要。在这里，我们证明抗凋亡BCL-2家族蛋白通过拮抗BAX和BAK依赖性凋亡，促进转化的幼鼠肾（BMK）上皮细胞的肿瘤形成。体内细胞死亡与缺氧和PUMA（p53上调凋亡调节剂）的诱导有关。引人注目的是，由转化的BMK细胞形成的癌中，凋亡被异常的BCL-2家族蛋白功能阻断，显示出普遍的高度多倍体肿瘤巨细胞。体内对转化的BMK细胞的检查显示，早在植入后9天，肿瘤中就出现了异常的中期和倍性变化，在致瘤过程中，这种变化的程度不断增加。体外缺血系统模拟了肿瘤的微环境，BCL-2的增加或BAX和BAK的丢失足以抵抗凋亡并允许多倍体细胞在体外积聚。这些数据表明，在体内，即使在p53功能受损的细胞中，凋亡也是肿瘤微环境中对缺氧和缺血的一种基本反应，这种反应的消除可以使基因组异常的细胞存活并促进肿瘤发生。

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数字

图1。
图1。
抗凋亡BCL-2家族蛋白阻断凋亡并促进肿瘤形成。(一)稳定细胞系的产生。用表达BAX和BAK（W2）的稳定BMK细胞或缺乏BAX和BAK（D3）的细胞提取物，用BCL-2特异性抗体进行Western blotting(左上面板）或E1B 19K(右上面板）。请注意三个独立克隆中每个外源蛋白的类似表达水平（用数字表示），以及仅在载体控制细胞系（W2.3.1–2,5,6或D3.zeo-1,2,3）中检测不到的每个外源蛋白水平。然后用肌动蛋白抗体重制印迹，以验证所有通道中几乎相等的蛋白质水平，如图所示在下面BCL-2和E1B 19K配线架。(B类)BCL-2和E1B 19K阻断staurosporine诱导的细胞凋亡。表达BCL-2、E1B19K的稳定BMK细胞系和对照用单独的培养基（开放条）或含有0.4μM星形孢菌素的培养基（填充条）处理24小时，并通过台盼蓝排除法测定活细胞数。结果以每种条件下活细胞的百分比表示，在每种情况下代表三个独立平板的平均值。(C类)BCL-2和E1B 19K拮抗BAX和BAK促进肿瘤形成。将表达BCL-2（绿色符号）、E1B 19K（蓝色符号）或对照（红色符号）的三种独立的稳定BMK细胞系（圆形、正方形和菱形）皮下注射到裸鼠中，并随着时间的推移监测肿瘤的形成。每个点代表五只注射动物的平均肿瘤体积。表达BAX和BAK的W2细胞如左边面板。BAX和BAK均缺乏的D3细胞如图所示正确的面板。请注意，BCL-2或E1B 19K的表达导致W2细胞中肿瘤形成的深度加速，而BAX和BAK均缺乏的D3细胞中肿瘤生成的动力学未被BCL-2和E1B 19K的表达所改变。
图2。
图2。
BAX和BAK的缺失或BCL-2的增加阻止裸鼠的细胞死亡。将表达红色荧光蛋白（RFP）的转化BMK细胞皮下注射到裸鼠体内。用耳塞标记小鼠，并用全身荧光成像系统对单个小鼠进行长期监测，以跟踪注射的BMK细胞。图中显示了每个细胞系的一只代表性动物。注意对照转化的BMK细胞中RFP信号的逐渐丢失（W2.3.1-5），这在很大程度上是由BAX和BAK的丢失（D3.zeo-2）或BCL-2的增益（W2.Bcl2-3）所阻止的。
图3。
图3。
小鼠BMK细胞死亡伴随着缺氧。注射BMK细胞的组织学显示，在大的坏死中心有广泛的细胞死亡。第2天从动物身上切除的BMK细胞团的苏木精和伊红（H&E柱）染色切片(顶部面板）和9(底部面板）显示为200×。显示了坏死区域（N）。插图显示W2.3.1-5细胞以凋亡形态死亡，明显表现为死亡细胞中的多个浓缩染色质隔室，以及坏死形态，明显表现出死亡细胞中单个大的浓缩染色质斑。相反，死亡的W2.Bcl2–3和D3.zeo-2细胞仅显示坏死形态（1000×）。每个面板中的白色矩形表示放大的区域插入箭头表示注射后第9天存活的W2.3.1-5细胞的散在斑块。用腺病毒E1A特异性抗体（E1A柱）对H&E染色切片附近的切片进行免疫组织化学染色，以区分转化的BMK细胞和宿主组织（E1A反应细胞染色为棕色）。通过免疫组织化学方法对缺氧探针加合物（缺氧探针柱）进行E1A免疫组织化学邻近切片，以显示肿瘤的缺氧区域（棕色染色）。使用活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（活性半胱天冬酶3柱）特异性抗体制作了几乎相邻的切片，以显示正在发生凋亡的细胞（染成棕色）。插图在W2.3.1–5细胞团中显示活性caspase 3反应性凋亡细胞，600×，白色矩形表示在插入.
图4。
图4。
BMK细胞在体内缺氧诱导HIF-1α和PUMA。对从动物身上切下的转化BMK细胞提取物进行HIF-1α的Western印迹(一)或PUMA和BIM(B类). 对于所有细胞系，C表示在注射到动物体内之前从相同细胞系中提取的对照提取物，而2和9表示分别在注射后第2天和第9天从动物体内提取的BMK细胞团中提取的提取物。在一标记为N和H的通道分别表示从正常氧气培养和体外缺氧培养12小时的细胞中提取的提取物。这个底部面板表示每个印迹上的肌动蛋白水平，以证明等效的蛋白质负荷。(C类)PUMA导致BAX和BAK依赖性细胞死亡。含有BAX和BAK的W2细胞，以及同时缺乏BAX和BAK的D2细胞，用质粒转染PUMA、BH3结构域缺失的PUMA或pCEP-4载体控制(C类). 24小时后，按照《材料和方法》中的描述测定存活率。注意，由于缺乏BAX和BAK（D2细胞），W2细胞的BH3依赖性杀伤被完全阻断。
图5。
图5。
凋亡缺陷肿瘤中肿瘤巨细胞的形成。(一)苏木精和伊红染色切片显示，表达BCL-2或E1B 19K的转化BMK细胞的肿瘤中存在大量肿瘤巨细胞。文中描述的典型肿瘤切片以200倍的放大倍数显示，突出显示了注射表达BCL-2或E1B 19K的转化BMK细胞的动物肿瘤中肿瘤巨细胞的富集区域插入有丝分裂中的大量多倍体细胞（放大1000倍）。每个图像中的几个肿瘤巨细胞用白色箭头表示。注意W2.3.1-5细胞形成的肿瘤中没有肿瘤巨细胞。对富含肿瘤巨细胞的肿瘤区域的典型部分进行了腺病毒E1A的免疫染色，以证明肿瘤巨细胞来源于输入转化的BMK细胞。请注意，E1A免疫组织化学中的许多肿瘤巨细胞呈棕色，包括箭头所示的几个例子。用YOYO-1对富含肿瘤巨细胞（箭头）的肿瘤切片（20μm）进行染色，以显示文本中所述的DNA含量。此图像显示为630×。(B类)在肿瘤进展过程中，异常中期和多倍体细胞积聚。肿瘤切片是用磷脂酶H3特异性抗体通过免疫组织化学方法制作的，显示为200×。黑色箭头表示异常的多倍体有丝分裂阵列，在插入已装箱。顶部面板代表成熟肿瘤的切片图像。注射后第2天和第9天从小鼠身上切下的转化BMK细胞团切片的磷甾酮H3免疫组化显示在底部两排（200×）。插图在磷酸化组蛋白H3面板中，以600倍的速度拍摄插入已装箱。第9天W2.Bcl2–3和D3.zeo-2细胞（而非W2.3.1–5细胞）中有明显的磷酸化氢istone H3染色的有丝分裂阵列的严重异常，在插入白色箭头。显示坏死中心（N）。
图6。
图6。
细胞凋亡缺陷可抵抗缺血诱导的细胞死亡，并允许多倍体细胞在体外对缺血作出反应。(一)BCL-2的增加或BAX和BAK的丢失阻止了缺血诱导的细胞死亡。将转化的BMK细胞系置于体外缺血培养条件下，并在指定日期测定其活性。绘制每个时间点的三倍结果。(B类)PUMA是由体外缺血诱导的。对在正常对照条件（C）或缺血培养条件（I）下培养24小时的细胞提取物进行PUMA、BIM和肌动蛋白免疫印迹。注意在缺血培养条件下PUMA的诱导，而不是BIM。(C、 D类)BCL-2的获得或BAX和BAK的损失允许多倍体细胞的积累以响应缺血。转化后的BMK细胞系在缺血培养条件下培养2 d，然后在完全培养基中恢复正常培养条件3 d(C类)在缺血前、缺血后2天和缺血后再恢复正常培养条件3天收集细胞，并通过流式细胞仪进行分析。插图通过盖玻片上细胞的DAPI染色显示每种情况下的典型核形态。箭头表示W2.Bcl2-3和D3.zeo-2细胞中典型的多/巨核，箭头表示W2.3.1-5细胞在缺氧中死亡。(D类)用共聚焦激光扫描显微镜对DAPI染色的典型多倍体细胞进行成像。在每个面板中，图片中包含一个正常大小的细胞核以供比较。多倍体细胞的总DNA含量与对照细胞总DNA含量的比值包含在插入对于每个面板。
图7。
图7。
肿瘤选择和进展模型。有关解释，请参阅文本。
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