Induction of cellular immune responses to simian immunodeficiency virus gag by two recombinant negative-strand RNA virus vectors

doi:10.1128/JVI.78.17.9366-9375.2004

.2004年9月；78(17):9366-75.

doi:10.1128/JVI.78.17.9366-9375.2004。

两种重组负链RNA病毒载体诱导猴免疫缺陷病毒gag的细胞免疫应答

中谷由丽（Yurie Nakaya）¹, 中谷隆树, Man-Seong公园, 杰罗姆·克罗斯, 伊曼尼西（Jiro Imanishi）, 帕雷斯, 阿道夫·加西亚·萨斯特雷

附属公司

PMID： 15308731
预防性维修识别码： PMC506935型
内政部： 10.1128/JVI.78.17.9366-9375.2004年

两种重组负链RNA病毒载体诱导猴免疫缺陷病毒gag的细胞免疫应答

中谷由丽（Yurie Nakaya）等。 J维罗尔. 2004年9月.

.2004年9月；78(17):9366-75.

doi:10.1128/JVI.78.17.9366-9375.2004。

作者

中谷由丽（Yurie Nakaya）¹, 中谷隆树, Man-Seong公园, 杰罗姆·克罗斯, 伊曼尼西（Jiro Imanishi）, 帕雷斯, 阿道夫·加西亚·萨斯特雷

附属

¹美国纽约州纽约市西奈山医学院微生物系，邮编：10029。

PMID： 15308731
预防性维修识别码： PMC506935型
内政部： 10.1128/JVI.78.17.9366-9375.2004年

摘要

产生表达猴免疫缺陷病毒（SIV）Gag蛋白（rNDV/SIVgag）的重组新城疫病毒（rNDV）。rNDV/SIVgag病毒在小鼠中诱导Gag特异性细胞免疫反应，导致特异性抗Gag抗病毒免疫。在rNDV/SIVgag-免疫小鼠中，表达相同Gag抗原的重组痘苗病毒（rVac/SIVgag）的生长受到抑制，但野生型痘苗病毒的生长没有受到抑制。在静脉、腹腔或鼻内免疫途径中，鼻腔给药对rVac/SIVgag的激发产生了最强的保护性反应。我们进一步证明，用表达SIV-Gag免疫原性部分的重组流感病毒进行强化免疫后，这些免疫反应大大增强。保护性免疫反应的程度与细胞对Gag的免疫反应水平相关，免疫9周后仍很明显。这些结果表明，rNDV和流感病毒载体是防治艾滋病和其他传染病的合适候选疫苗。

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数字

**图1。**
用于免疫接种的重组病毒。（A） rFlu/SIVgag病毒中Flu/SIVgag/2A/NA基因的示意图。rFlu/SIVgag病毒的构建如前所述（31）。简单地说，通过使用NheI和HpaI限制性位点，将SIV-Gag特异性序列以负义插入神经氨酸酶（NA）基因的3′非编码区和口蹄疫病毒衍生的蛋白酶识别序列2A（NFDLLKLAGDVESNPGP）之间（41），并将相应的基因拯救到感染性流感病毒中。由于2A蛋白酶的自催化活性，表达的Gag-2A-NA多聚蛋白被切割成Gag-2A和NA多肽（44）。然而，值得注意的是，最近的证据支持2A的作用机制，因为“核糖体跳跃”，而不是蛋白水解自分裂（12）。ELISPOT分析中使用的Gag抗原中的肽3和肽4也显示出来。这两种肽先前被发现含有CD8识别的表位⁺BALB/c小鼠中的T细胞（31）。（B）用于救援rNDV/SIVgag的pNDV/B1-SIVgag的示意图。pNDV/B1 SIVgag构建体是通过将SIV Gag基因插入位于原始pNDV/B1克隆的P和M基因之间的独特XbaI克隆位点（核苷酸3163）而制备的（30）。插入的基因包含NDV RNA依赖性RNA聚合酶将SIV Gag作为新转录单位表达所需的基因末端、基因间和基因起始序列（5′-TTAGAAAAAATACGTGTAGAA-3′）。此外，在SIV-Gag起始位点上游插入7个核苷酸（5′-CGCACC-3′），以引入最佳Kozak序列（24）。编码的NDV基因组的最终长度可被6整除。所示质粒区域不符合比例。

**图2。**
SIV-Gag蛋白在感染rNDV/SIVgag病毒的Vero细胞中的表达。感染后第2天固定rNDV/SIVgag病毒感染细胞，并用渗透细胞进行免疫荧光分析。如材料和方法所述，使用抗SIV-Gag单克隆抗体证明SIV-Gag蛋白表达。感染野生型rNDV/B1病毒的Vero细胞作为阴性对照。

**图3。**
rNDV/SIVgag在鸡胚中的生长动力学。用100个rNDV/B1或rNDV/SIVgag病毒PFU接种胚胎卵，并在不同时间点（接种后24、48和72小时）采集尿囊液。这些时间点的病毒滴度被确定为TCID₅₀通过免疫荧光分析。简单地说，含有70%至80%融合Vero细胞的96个平板被连续10倍尿囊液稀释液感染（每次稀释4孔）。将细胞孵育2天，然后用含有0.1%Triton X-100的2.5%甲醛固定。使用抗NDV兔血清和异硫氰酸荧光素结合的抗兔IgG观察病毒蛋白。

**图4。**
用rNDV/SIVgag病毒免疫小鼠的挑战实验。rNDV/SIVgag病毒（5×10⁷PFU）接种一次（一次）或两次（两次）给三组小鼠，每组三只，分别经鼻内、腹腔内或静脉注射。对照组小鼠接种PBS。最后一次接种三周后，小鼠经鼻或静脉感染5×10⁶Vac/wt或rVac/SIVgag病毒的PFU。接种痘苗病毒五天后，处死小鼠，测定肺部痘苗病毒滴度。用1 ml PBS中的均质肺测定CV-1细胞中的痘苗病毒滴度。

**图5：。**
用rNDV/SIVgag病毒和/或rFlu/SIVgag病毒免疫小鼠的挑战性实验。rNDV/SIVgag病毒（5×10⁷PFU），每个rFlu/SIVgag病毒（5×10²PFU），或rFlu/SIVgag 3号和rFlu/SIVgag 4号病毒（5×10）的混合物²PFU）经鼻给药给三组小鼠。对照小鼠接种PBS。接种三周后，用rNDV/SIVgag病毒（5×10⁷PFU），每个rFlu/SIVgag病毒（5×10²PFU）或rFlu/SIVgag病毒的混合物（5×10²PFU）。免疫后3周，小鼠经鼻感染5×10⁶Vac/wt或rVac/SIVgag病毒的PFU。接种痘苗病毒五天后，处死小鼠，测定肺部痘苗病毒滴度。

**图6。**
SIV Gag肽特异性IFN-γ产生CD8的定量⁺接受初始和增强免疫的小鼠中的T细胞。每组3只小鼠经鼻接种rFlu/SIVgag 3号（5×10）²PFU），rFlu/SIVgag编号4（5×10²PFU）和rNDV/SIVgag（5×10⁷PFU）。在增强后5天或30天采集脾细胞（A）和来自颈部和纵隔淋巴结（B）的淋巴细胞（B）。CD8（CD8）⁺在ELISPOT分析中，选择T细胞并与特定Gag肽脉冲P815细胞孵育。Gag肽3和4用于刺激CD8⁺分别来自rFlu/SIVgag 3号和rFlu/SIVgag 4号病毒免疫动物的T细胞。作为对照，CD8⁺使用来自接种PBS小鼠脾脏和淋巴结的细胞。代表了每百万个细胞中IFN-γ分泌细胞相对于Gag肽的数量。

**图7。**
用rNDV/SIVgag和rFlu/SIVgag病毒免疫小鼠，维持对SIV-Gag的抗病毒细胞免疫。每组3只小鼠经鼻接种rNDV/SIVgag（5×10）⁷PFU），然后用rFlu/SIVgag（5×10）增压²PFU），如图所示。接种rFlu/SIVgag病毒后3周（第1组）、6周（第2组）和9周（第3组），免疫小鼠用5×10⁶Vac/wt或rVac/SIVgag病毒的PFU。第4组包括未免疫的对照动物。在痘苗病毒攻击后5天处死小鼠，并测定肺部痘苗病毒滴度。

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