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.2004年9月；78(17):9317-24.
doi:10.1128/JVI.78.17.9317-9324.2004。

诱导有效细胞免疫反应的非致病性活病毒疫苗载体的特性

Jean Publicover公司 1, 伊丽莎白·拉姆斯堡, 约翰·K·罗斯
附属公司

诱导有效细胞免疫反应的非致病性活病毒疫苗载体的特性

Jean Publicover公司等。 J维罗尔. 2004年9月.

摘要

基于表达外源病毒蛋白的重组水泡性口炎病毒（VSV）的实验疫苗在几种动物疾病模型中具有保护作用。虽然这些减毒病毒通过鼻、口或肌肉途径给药对非人类灵长类动物无致病性，但经鼻给药对小鼠有致病性，在开始使用基于VSV的载体进行人体试验之前，可能需要进一步减弱载体。先前研究表明，将VSV糖蛋白（G）胞质结构域从29截断为9或1个氨基酸（分别指定为CT9或CT1）的突变会减弱小鼠细胞培养中VSV的生长和发病机制。在这里，我们表明携带CT1或CT9缺失并表达人类免疫缺陷病毒（HIV）Env蛋白的VSV重组体在小鼠中是非致病性的，即使是通过鼻内途径给药。然后，我们对这些载体诱导的CD8+T细胞反应进行了详细分析，包括体内细胞毒性T细胞活性。当通过鼻内或腹腔途径给药时，表达HIV Env的VSV-CT9载体对Env诱导的初级和记忆CD8+T细胞反应与表达Env的重组野生型VSV诱导的反应相当。经腹腔接种后，VSV-CT1载体也能诱导有效的CD8+T细胞反应，但经鼻途径接种时效果较差。VSV-CT1载体在诱导抗Env抗体方面也远不如VSV-CT9或野生型载体有效。VSV-CT9载体似乎很理想，因为它缺乏致病性，在体外可以传播到高滴度，并且可以刺激强烈的细胞和体液免疫反应。

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数字

图1。
图1。
病毒基因组和蛋白质表达。（A） VSV重组体中的基因顺序，在负链RNA基因组上绘制了3′至5′的图表。在减毒载体中，VSV G的29氨基酸胞质尾部被截断为9个氨基酸（CT9）或1个氨基酸（CT 1）。（B） 感染指示病毒的BHK细胞裂解物的SDS-PAGE[35S] 蛋氨酸。凝胶图像收集在PhosphorImager上。指出了VSV和EnvG蛋白的位置。
图2。
图2。
通过接种疫苗后的体重减轻来衡量发病率。7周龄雌性BALB/c小鼠经静脉接种VSV-EnvG（实心三角形）、VSV-CT9EnvG、VSV-CT1EnvG（实心钻石）、rVSV（方形开口）或DMEM（圆形开口）。每天接种疫苗后，在同一时间对小鼠称重（每组至少三只）。误差条是平均值的标准误差。
图3。
图3。
抗原特异性CD8的检测+静脉接种后的T细胞。小鼠腹腔接种VSV-EnvG、VSV-CT9EnvG或VSV-CT1EnvG。分离脾细胞并用抗CD8、Env四聚体和抗CD62L染色。（A）典型荧光激活细胞分选（FACS）图（在CD8上预处理+T细胞）。每个图左上角的数字表示CD8的百分比+Env四聚体T细胞+和CD62L洛（B）Env四聚体百分比图+CD62L型洛CD8（CD8）+接种VSV-EnvG（填充方块）、VSV-CT9EnvG或VSV-CT1EnvG后指定天数的T细胞。误差条是平均值的标准误差（每点三到五只老鼠）。每个病例中减去接种rVSV（≥0.40%）的小鼠的背景。（C） 通过细胞内细胞因子染色分析IFN-γ的产生。接种后7天，分离脾细胞并分析其细胞内IFN-γ的产生。条形代表四聚体特异性CD8的百分比+刺激后产生IFN-γ的T细胞±平均值的标准误差。每个时间点至少分析三只动物。
图4。
图4。
免疫接种后体内细胞毒性T细胞杀伤的定量。小鼠腹腔接种rVSV(n个=3），VSV-EnvG(n个=3），VSV-CT9EnvG(n个=3）和VSV-CT1EnvG(n个= 3). 在疫苗接种后7天，给小鼠静脉注射来自幼稚小鼠的两个脾细胞群。一个群体装载p18-I10 Env肽并标记高浓度CFSE，另一个群体未装载肽并标记低浓度CFSE。（A） 每组具有代表性的FACS直方图。（B） CFSE百分比你好和CFSE洛在感染rVSV（53.5%和45.7%）、VSV-EnvG（15%和83.6%）、VSV CT9 EnvG和VSV-CT1EnvG的小鼠中观察到的病毒，用于计算特异性杀伤百分比。如材料和方法所述，获得了接种小鼠肽负载细胞的特异性杀伤百分比。以接种rVSV的小鼠作为对照。条形图显示了每个组的平均特定杀戮百分比。误差条表示平均值的标准误差。
图5：。
图5：。
免疫接种后抗体反应的ELISA检测。用VSV-EnvG（实心棒）、VSV-CT9EnvG或VSV-CT1InvG（阴影棒）对小鼠进行i.p.（A）或i.n.（B）接种。接种后84天，用ELISA法分析血清gp140抗体滴度。条形图表示415 nm处吸光度在背景上为0.1的反向稀释。所有条表示至少三只小鼠的混合血清（±三倍微孔平均值的标准误差）。背景是用未接种疫苗的小鼠的对照血清获得的。
图6。
图6。
抗原特异性CD8的检测+免疫接种后的T细胞。小鼠经静脉接种VSV-EnvG、VSV-CT9EnvG或VSV-CT1EnvG。分离脾细胞，并用抗CD8、Env四聚体和抗CD62L染色。（A）代表性FACS图（在CD8上预处理+T细胞）。每个图左上角的数字表示CD8的百分比+Env四聚体T细胞+和CD62L洛（B）Env四聚体百分比图+，CD62L洛CD8（CD8）+接种VSV-EnvG（填充方块）、VSV-CT9EnvG或VSV-CT1EnvG后指定天数的T细胞。误差条是平均值的标准误差（每点三到五只老鼠）。每个病例中减去接种rVSV（≥0.16%）的小鼠的背景。（C） 通过细胞内细胞因子染色分析IFN-γ的产生。接种后7天，分离脾细胞并分析其细胞内IFN-γ的产生。条形代表四聚体特异性CD8的百分比+在接种了指示病毒的动物中，用肽刺激后产生IFN-γ的T细胞（误差条是平均值的标准误差）。每个时间点至少分析三只动物。
图7。
图7。
免疫接种后体内细胞毒性T细胞杀伤的定量。小鼠经静脉接种rVSV(n个=3），VSV-EnvG(n个=3），VSV-CT9EnvG(n个=3），或VSV-CT1EnvG(n个= 3). 在接种疫苗后7天，向小鼠静脉注射两组来自幼年小鼠的脾细胞。一个群体装载p18-I10 Env肽并标记高浓度CFSE，另一个群体未装载肽并标记低浓度CFSE。（A） 每组具有代表性的FACS直方图。（B） CFSE的百分比你好和CFSE洛在感染rVSV（49.9%和49.8%）、VSV-EnvG（8.45%和91.5%）、VSV CT9 EnvG和VSV-CT1EnvG的小鼠中发现的病毒用于计算特异性杀伤百分比。如材料和方法所述，获得了接种小鼠肽负载细胞的特异性杀伤百分比。以接种rVSV的小鼠作为对照。条形图显示每个组的平均特定杀戮百分比。误差条表示平均值的标准误差。
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