Cluster analysis of mass spectrometry data reveals a novel component of SAGA

doi:10.1128/MCB.24.16.7249-7259.2004

.2004年8月；24(16):7249-59.

doi:10.1128/MCB.24.16.7249-7259.2004。

质谱数据的聚类分析揭示了SAGA的一种新成分

大卫·W·鲍威尔¹, 康妮·M·韦弗, 詹妮弗·詹宁斯, K吉尔·麦卡菲, 岳河, P安东尼·威尔, 安德鲁·林克

附属公司

PMID： 15282323
预防性维修识别码：项目经理479721
内政部： 10.1128/MCB.24.16.7249-7259.2004

质谱数据的聚类分析揭示了SAGA的一种新成分

大卫·W·鲍威尔等。分子细胞生物学. 2004年8月.

.2004年8月；24(16):7249-59.

doi:10.1128/MCB.24.16.7249-7259.2004。

作者

大卫·W·鲍威尔¹, 康妮·M·韦弗, 詹妮弗·詹宁斯, K吉尔·麦卡菲, 岳河, P安东尼·威尔, 安德鲁·林克

附属

¹美国田纳西州纳什维尔范德比尔特大学医学院微生物与免疫学系，邮编37232-2363。

PMID： 15282323
预防性维修识别码：第479721页
内政部： 10.1128/MCB.24.16.7249-7259.2004

摘要

SAGA组蛋白乙酰转移酶和TFIID复合物在真核转录中起关键作用。使用质谱数据的层次聚类分析来鉴定与芽殖酵母TFIID转录复合物组分共纯化的蛋白质，我们发现对应于YPL047W开放阅读框的非特征化蛋白质与TFIID和SAGA复合物的共享组分显著相关。通过质谱和生化分析，我们发现YPL047W（SGF11，11-kDa SAGA相关因子）是SAGA的一个完整亚基。然而，SGF11似乎在SAGA介导的组蛋白乙酰化中不起作用。DNA微阵列分析表明，SGF11介导SAGA依赖性基因子集以及SAGA依赖基因的转录。从sgf11 Delta缺失株纯化的SAGA减少了Ubp8p的数量，ubp8 Delta缺失菌株显示出与sgf11 Delta缺失株类似的转录变化。总之，这些数据表明Sgf11p是酵母SAGA复合物的一种新成分，并且SGF11调节SAGA调节基因子集的转录。我们的数据表明，SGF11在转录中的作用独立于SAGA的组蛋白乙酰转移酶活性，但可能涉及到SAGA中Ubp8p的招募或稳定。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
蛋白质组数据的聚类分析确定YPL047W是SAGA的候选亚单位。左边的聚类图显示了来自TFIID每个成分的复制免疫亲和纯化和对照纯化的蛋白质组数据的无监督分层聚类（41）。右边的放大图扩大了簇显示，在簇显示中观察到一种蛋白质与一组不同的TAF共纯化的模式。该蛋白质簇包括SAGA的所有先前特征成分和对应于未特征化ORF（uORF）YPL047W的蛋白质。SAGA蛋白与已知由TFIID和SAGA共享的五个TAF聚集在一起。这些共享的TAF标有星号。每种鉴定蛋白质的估计相对丰度PAF（见材料和方法）用红色阴影表示。对照实验中鉴定的蛋白质的PAF用绿色阴影表示。如果从实验的质谱数据的计算分析中没有检测到蛋白质，则方框为黑色。左边的聚类图显示了与特定TFIID亚单位相关的其他蛋白质组，这些蛋白质组在本报告中未提及（McAfee等人，未发表）。

**图2。**
SAGA成分用酵母提取物中的TAP-Sgf11p进行铜净化。（A）从TAP纯化后回收的蛋白质-*11新加坡元*酵母菌株经SDS-PAGE分离和银染。（B）用TAP-Sgf11p纯化的蛋白质经DALPC质谱鉴定。所列蛋白均未从对照纯化中鉴定出来。识别每个蛋白质和PAF的非冗余光谱数量（光谱归一化为同源蛋白质的分子量[MW][10⁴])如图所示。质谱鉴定的全套蛋白质可在http://linklab.mc.vanderbilt.edu.

**图3。**
Sgf11p与SAGA亚基Gcn5p和Spt7p进行铜纯化。用含有表达V5标记的质粒的酵母菌株进行免疫亲和共纯化测定-*11新加坡元*（p是-*11新加坡元*)或空向量（pYes-DEST52）。蛋白质通过免疫印迹（IB）分析如下。每个面板左侧的数字代表分子量标准。（A）用抗V5抗体检测细胞裂解物。V5融合蛋白的预期分子量为13 kDa。分别用抗Gcn5p和抗Spt7p抗体对（B和C）蛋白进行免疫亲和纯化（IP），并用抗V5抗体进行检测。用Gcn5p和Spt7p回收V5-Sgf11p。（D）仅用蛋白A-Sepharose纯化的蛋白质用抗V5抗体进行检测。未回收V5-Sgf11p。（E）用抗V5抗体纯化的蛋白质免疫亲和性（IP）用抗Spt7p抗体检测。使用V5-Sgf11p恢复Spt7p。

**图4。**
Ubp8p与SAGA的关联在*sgf11型*缺失菌株。（A）用来自野生型和*sgf11Δ*用抗Ubp8p抗体检测缺失菌株。Ubp8p的回收率在从*sgf11型*缺失菌株。还显示了Ubp8p在细胞裂解物中的输入。（B）用来自野生型和*sgf11型*用Taf12p、Gcn5p、Tra1p和Taf10p的抗体检测缺失菌株。

**图5：。**
SAGA的HAT活动不需要Sgf11p。SAGA复合物用抗Gcn5p抗体从指示菌株中进行免疫亲和纯化，并用于含有核小体组蛋白和³H-乙酰-CoA。（A）对每个HAT测定的等分试样进行SDS-PAGE，然后进行放射自显影，以显示标记的组蛋白。（B）用抗Gcn5p抗体对相同反应的等分样品进行免疫印迹（IB），以显示Gcn5p的恢复。

**图6。**
*11新加坡元*和*UBP8（UBP8）*调节转录。从带有*sgf11型*或*ubp8*删除被用作RT-PCR中的模板。第15周期的产物在聚丙烯酰胺凝胶上分离，并用溴化乙锭染色。左边的数字表示基本对标准。表达的变化*材料α1*和*CDC8公司*在突变株中检测到。的放大产品*TDH3型*用作加载控制。

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