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.2004年8月18日；23（16）：3216-26。
doi:10.1038/sj.emboj.7600333。 Epub 2004年7月22日。

BNIP1参与细胞凋亡和内质网膜融合

中岛贤一 1, Hidenori Hirose公司, 谷口美, 黑岛博文, 小黑荒崎, Masami Nagahama公司, 卡佐科·塔尼（Katsuko Tani）, 山本昭一, 三雄田谷
附属公司

BNIP1参与细胞凋亡和内质网膜融合

中岛贤一等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

BNIP1是仅有BH3的蛋白质家族的成员，首次被发现是能够与抗凋亡腺病毒E1B19kDa蛋白相互作用的蛋白质之一。在这里，我们公开了一个完全出乎意料的发现，即BNIP1是包含突触融合蛋白18的复合物的一种成分，突触融合蛋白18是一种位于内质网（ER）的可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子（NSF）附着蛋白（SNAP）受体（SNARE）。功能分析表明，BNIP1参与了内质网结构的形成，但不参与内质网和高尔基之间的膜运输。值得注意的是，BNIP1的BH3结构域中一个高度保守的亮氨酸残基不仅在诱导凋亡中起重要作用，而且在α-SNAP的结合中也起重要作用。这预示着α-SNAP可能通过与BNIP1的BH3结构域的抗凋亡蛋白竞争来抑制凋亡。事实上，α-SNAP的过度表达显著延缓了staurosporine诱导的细胞凋亡。我们的结果揭示了明显独立的细胞事件、凋亡和ER膜融合之间可能存在的串扰。

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数字

图1
图1
BNIP1和Sec20p之间的序列相似性。(一个)相关蛋白质发现于智人（Hs.BNIP1），酿酒酵母（参见第20p节），葡萄裂殖酵母（参见CAA16989），白色念珠菌（约Sec20p），黑腹果蝇（图纸AAF51945）和拟南芥（位于BAB02931）。星形代表BNIP1和酵母Sec20p之间的相同氨基酸。(B类)BNIP1的域结构。恒星代表BH3结构域中高度保守的氨基酸残基。
图2
图2
BNIP1是syntaxin 18复合物的组成部分。(一个)用1μg的pFLAG-BNIP1（第2和第4道）或pFLAG（第1和第3道）转染293T细胞。24小时后，用Triton X-100裂解细胞，并用抗FLAG M2单克隆抗体和蛋白G珠免疫沉淀。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离免疫沉淀蛋白，并用所示抗体（3道和4道）进行免疫印迹分析。还分析了输入（占总输入的2.5%）（车道1和2）。星形表示免疫球蛋白轻链。注意，GS27没有与抗FLAG共沉淀。(B类)用对照IgG（第2道）或抗BNIP1抗体（第3道）免疫沉淀293T细胞裂解物。用所示抗体通过免疫印迹法分析共沉淀蛋白。还分析了输入（占总输入的4%）（车道1）。星形表示免疫球蛋白重链或轻链。(C类)293T细胞裂解物用对照抗体（第2道）或单克隆抗突触蛋白18抗体（克隆1E1）免疫沉淀（第3道）。用所示抗体通过免疫印迹法分析免疫沉淀蛋白。还分析了输入（占总输入的4%）（车道1）。
图3
图3
BNIP1在有利于SNARE复合物分解的条件下与syntaxin 18及其结合蛋白分离。(一个)293T细胞裂解物在指定的条件下培养（NSF:10μg/ml；α-SNAP:5μg/ml，ATP:0.5 mM；MgCl2：8 mM）在16°C下培养60分钟。培养后，用抗syntaxin 18（1-4道）、BNIP1（6-9道）、p31（11-14道）或RINT-1（16-19道）的抗体对样品进行免疫沉淀。用所示抗体通过免疫印迹法分析沉淀蛋白。还分析了输入（占总输入的4%）（第5、10、15和20车道）。(B类)293T细胞裂解物在诱导SNARE复合物分解的条件下未经培养（顶部面板）或培养（底部面板），在12–48%甘油梯度（Hirose等, 2004). 用所示抗体通过免疫印迹法分析每个组分。
图4
图4
BNIP1功能丧失导致ER网络中断。GFP-b5-表达HeLa细胞(一个)或非表达细胞(B类)在没有（模拟处理）或低效RNA双链（siRNA（532-552））或高效RNA双链的情况下转染，并孵育24小时。免疫印迹（A）和免疫荧光显微镜分析（B）显示，转染siRNA的细胞中BNIP1表达显著降低（155-175）。(C类)如上所述进行转染。研究了活细胞的内质网形态。方框区域的放大图像显示在右侧。棒材，10μm。(D类)微量注射对照IgG或BNIP1抗体，并研究活细胞的内质网形态。棒材，10μm。(E类)ER的三向接头数量的量化。
图5
图5
BH3结构域中的Leu-114是α-SNAP结合所必需的。(一个)用编码野生型BNIP1和所示BH3结构域突变体的pFLAG构建物转染生长在六孔板上的293T细胞。转染后24小时，制备细胞裂解物，并用抗FLAG抗体免疫沉淀FLAG标记蛋白。用SDS-PAGE分离免疫沉淀蛋白，并用所示抗体进行免疫印迹分析（下表）。还分析了输入（占总输入的4%）（上面板）。(B类)纯化GST（1号道）、GST-BNIP1野生型（2号道）和GST-BNIP 1 L114A（3号道）及His的考马斯染色6-α-SNAP（车道4）。伊斯6-α-SNAP（1μg）与GST、GST-BNIP1野生型或GST-BNIP 1 L114A（各1μg，4°C）孵育60分钟。用谷胱甘肽珠拖出GST融合蛋白。通过SDS–PAGE分离下拉蛋白，并使用针对His标签和GST的抗体进行免疫印迹分析（通道8–10）。还分析了输入（总计4.5%）（5-7车道）。星形代表假定的降解产物。
图6
图6
Leu-114对于细胞凋亡诱导活性是重要的。(一个)BNIP1和L114A突变体对菌落形成的抑制。用所示质粒转染MCF-7细胞。细胞在0.8 mg/ml G418存在下培养2周，固定，用Giemsa溶液染色并计数。免疫印迹显示野生型BNIP1（第2道）和L114A突变体（第3道）的表达相同。通道1中的带代表内生BNIP1。(B类)用GFP（对照）或FLAG标记蛋白的质粒转染HeLa细胞。转染后24小时，用Hoechst 33342观察细胞核形态，以计数活细胞和凋亡细胞的数量。测定表达GFP、野生型BNIP1、L114A突变体或Bad的细胞中凋亡细胞的百分比。使用抗FLAG抗体的免疫印迹显示野生型BNIP1（第1道）、L114A突变体（第2道）和Bad（第3道）的表达相同。
图7
图7
α-SNAP过度表达可延缓细胞凋亡。(一个)HeLa-Tet-on细胞生长在盖玻片上，用1μg/ml多西环素诱导蛋白质表达。诱导后48 h，用1μM staurosporine处理细胞3.5 h。对于Tet-On HeLa/HA-α-SNAP细胞，用抗HA抗体固定细胞，然后用荧光素异硫氰酸标记的二级抗体孵育细胞。分别用Hoechst 33342和活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3抗体观察细胞核形态和活性形式的半胱氨酸蛋白酶-3。箭头和箭头分别表示表达异位蛋白的细胞中的活细胞和凋亡细胞。注意，并非所有细胞都表达α-SNAP。这使我们能够确定在相同条件下，非表达或表达α-SNAP的细胞中凋亡细胞的百分比。棒材，20μm。(B类)表达异位蛋白的细胞凋亡的时间进程。通过Hoechst 33342染色（左侧）或caspase-3激活（右侧）评估细胞凋亡。NE代表非表达细胞。(C类)用编码FLAG-标记的BNIP1野生型、L114A突变体或Bad的pTRE质粒转染诱导α-SNAP表达40 h的HeLa-Tet-on细胞。在1μg/ml多西环素存在下转染后16 h，用1μM staurosporine处理细胞1.5 h。固定细胞，用Hoechst 33342观察细胞核形态。
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    1. Baumann O，Walz B（2001）动物细胞的内质网及其在结构和功能领域的组织。细胞国际评论205:149–214-公共医学
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