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.2004年7月19日；166(2):193-203.
doi:10.1083/jcb.200309146。

Bcl-2在功能上与肌醇1,4,5-三磷酸受体相互作用，调节内质网对1,4,5-3磷酸肌醇的钙释放

陈锐（Rui Chen） 1, 伊格纳西奥·巴伦西亚, 费忠, 凯伦·麦克尔, H卢埃林·罗德里克, 马丁·D·布特曼, 迈克尔·J·贝里奇, 斯图亚特·康威, 安德鲁·霍姆斯, 格雷戈里是一个强者, 帕特里西奥·贝莱斯, 克拉克·W·迪斯特霍斯特
附属公司

Bcl-2在功能上与肌醇1,4,5-三磷酸受体相互作用，调节内质网对1,4,5-3磷酸肌醇的钙释放

陈锐（Rui Chen）等。 J细胞生物学. .

摘要

肌醇1,4,5-三磷酸（InsP3）受体（InsP3Rs）是负责内质网（ER）钙释放的通道。我们发现，抗凋亡蛋白Bcl-2（野生型或选择性定位于ER）显著抑制了InsP3介导的WEHI7.2 T细胞钙释放和胞浆钙升高。这种抑制是由于Bcl-2在InsP3Rs水平上的作用，因为对抗CD3抗体和细胞发酵InsP3酯的反应都降低了。Bcl-2抑制渗透性WEHI7.2细胞内质网钙释放的程度，即使在InsP3饱和浓度下，也不会降低管腔钙浓度。此外，Bcl-2降低了纯化的InsP3R重组为脂质双层的开放概率。通过共免疫沉淀和蓝色天然凝胶电泳，在大分子复合物中同时检测到Bcl-2和InsP3Rs。我们认为，Bcl-2与InsP3Rs的这种功能性相互作用抑制了InsP3R的激活，从而调节了InsP3诱导的内质网钙释放。

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数字

图1。
图1。
Bcl-2阳性克隆和阴性克隆的特征。非转染（野生型，WT）WEHI7.2细胞的细胞裂解产物的Western blot，用空载体（N1和N2）转染的对照克隆，以及稳定表达全长Bcl-2（B1、B13、B17和B27）的克隆。（A） 用抗-hBcl-2（人Bcl-2）抗体探测印迹，然后用抗肌动蛋白抗体重新处理以控制负载。（B） 用InsP抗体检测斑点三用SERCA3抗体检测Rs I和III.（C）印迹，然后用抗肌动蛋白抗体重制以控制装载。
图2。
图2。
Bcl-2抑制CD3/TCR介导的钙升高。在存在1.3 mM细胞外钙的情况下，使用钙指示剂Fura-2 AM通过单细胞钙成像测量细胞内钙浓度。（A） 比较Bcl-2阴性（N1）和阳性（B27）克隆的代表性钙微量。（B） 暴露于抗CD3抗体后，有反应或无反应的细胞数量显著增加，胞浆钙浓度比基线增加两倍。（C） 抗CD3诱导的峰值钙升高。分析中只包括对CD3抗体有反应的细胞。符号表示平均值±SEM，并总结了总共161个N1细胞（五个单独的实验）和181个B27细胞（六个单独的试验）的数据。采用Mann-Whitney U检验进行统计分析，并采用Wilcoxon秩和检验进行验证。
图3。
图3。
Bcl-2抑制抗CD3诱导的钙升高，但不抑制TG诱导的钙增高。在图1所示的多个Bcl-2阳性和阴性克隆中平行测量抗CD3抗体和TG诱导的细胞质钙升高。细胞在含有1.3 mM钙的ECB中培养，直到记录开始时添加EGTA螯合细胞外钙。荧光描记显示由抗CD3抗体（A）或100 nM TG（B）诱导的胞浆钙瞬时升高。直方图总结了多项实验中由抗CD3抗体（C）或100 nM TG（D）诱导的细胞溶质钙升高峰值（平均值±SEM）。F和G总结了多项实验（平均值±SEM），在这些实验中，在稳定表达Flag标记野生型Bcl-2和Flag标签ER靶向Bcl-2或对照表达载体（Neo）的WEHI7.2细胞中，测量了抗CD3（E）和100 nM TG（F）诱导的峰值钙升高。
图4。
图4。
Bcl-2不会降低管腔游离钙浓度。使用低亲和力钙敏感染料Fura-2FF AM测量游离内质网内质网钙浓度。（A）Fura-2FF荧光（左）和线粒体染料TMRE荧光（右）的细胞内定位被检测为非焦点Z系列叠加，然后进行去卷积。棒材，5μm。（B） 在340和380 nm激发下显示荧光发射的典型单细胞痕迹。细胞在ECB中悬浮时加载Fura-2FF AM。然后用补充有ATP生成系统和10μg/ml洋地黄素的ICB灌注细胞。当洋地黄素渗透细胞时，340和380 nm的荧光都显著降低。然后用含有10μM InsP的ICB灌注细胞三和100μM MnCl2.锰2+在InsP开启后，进入ER并熄灭灯具Fura-2FF三InsP的Rs三（C）监测340和380nm激发下的荧光比率的典型单细胞迹线。当细胞被洋地黄素渗透时，340:380的比率迅速增加。340:380的比率逐渐达到稳定水平。（D） 用洋地黄素渗透细胞后，基于稳态340:380比率的内质网钙浓度总结。在6个实验中进行了测量，其中59个Neo1对照细胞与50个B27细胞进行了平行比较，13个实验中180个Neo2对照细胞与85个B17细胞进行平行比较。符号表示平均值±SEM。采用Mann-Whitney U检验进行统计分析，并采用Wilcoxon秩和检验进行验证。
图5。
图5。
Bcl-2抑制细胞发酵剂InsP诱导的胞浆钙升高三酯类。在存在1.3 mM细胞外钙的情况下，使用钙指示剂Fura-2 AM通过单细胞钙成像测量细胞内钙浓度。（A） 比较Bcl-2阴性（N1）和阳性（B27）克隆的代表性钙微量。（B） 25μM InsP诱导的峰值钙浓度总结三酯在总共42个N1细胞和31个B27细胞上的三个单独实验中。符号代表平均值±SEM，用Mann-Whitney U检验进行统计分析，并用Wilcoxon秩和检验进行确认。
图6。
图6。
即使在InsP饱和浓度下，Bcl-2也会抑制钙释放的程度三.如图4所示，用Fura-2FF AM加载细胞以监测内质网管腔钙。用洋地黄素渗透细胞后，InsP浓度增加三在连续监测Fura-2FF 340:380比率的同时，按顺序添加。（A） 连续记录neo对照和Bcl-2过度表达的WEHI7.2细胞中的Fura-2FF比率。340:380比率的逐步下降对应于InsP引起的管腔钙的下降三-诱导钙释放到细胞质中。（B） 多个实验的线性最小二乘剂量反应分析，如面板A所示（符号表示九个单独实验的平均值±SEM）。（C） 将1μM TG添加到完整的未渗透的Fura-2FF负载细胞中，并连续监测Fura-2FF 340:380的比率。Fura-2FF比率的下降是由于TG介导的SERCA泵抑制导致管腔钙逐步下降。
图7。
图7。
Bcl-2降低InsP三R信道开放概率。单一InsP三将Rs掺入人工平面脂质双层中，在将约0.1μM纯化的全长Bcl-2添加到浸泡通道细胞质面的溶液中后，研究Bcl-2对通道活性的影响。（A） 显示控制条件下通道活性水平的代表性单通道轨迹（顶部轨迹；顺式/反式220 mM CsCH三SO公司三/20毫微米立方厘米三SO公司三，pH 7.4），在2μM InsP存在下三。保持电位为0 mV。通道开口被视为向上电流偏转。底部轨迹显示相同的InsP三将Bcl-2添加到顺式室后的R通道（通道的细胞质侧）。Bcl-2显著降低了开放概率。左侧的条指示零电流水平（闭合状态）。（B） 实验的所有点振幅直方图如A所示。开放概率的影响通过减少代表开放水平的峰值来证明。
图8。
图8。
Bcl-2存在于与InsP的复合物中三卢比。（A） Western blot显示细胞裂解物和表达Bcl-2的WEHI7.2细胞（克隆17）纯化ER膜中的calnexin和cox IV水平。（B） 用BN-PAGE鉴定纯化ER膜中的蛋白质复合物。分子量标记；ER，ER膜。I–IV指向从该凝胶中切下并通过SDS-PAGE分离的复合物。白线表示中间车道已拼接。（C） 用SDS-PAGE解析B的I–IV复合物，并用III型InsP抗体进行Western blotting分析三R（顶部）和人Bcl-2抗体（底部）。
图9。
图9。
Bcl-2与InsP的免疫共沉淀三卢比。（A） 督察三使用亚型非特异性抗体从N1和B17克隆中免疫沉淀Rs。免疫沉淀物用抗hBcl-2抗体进行Western blotting分析。“无ip”区的Western blotting显示了人Bcl-2的过度表达水平。（B） InsP公司三使用识别所有三种亚型（左）或每种亚型特异性抗体（第二至第四组）的抗体从N1和B17细胞中免疫沉淀Rs。免疫沉淀物用抗人Bcl-2抗体进行Western blotting分析。（C） 对人Bcl-2（即过度表达的Bcl-2）进行免疫沉淀，并使用InsP特异性抗体通过Western blotting分析免疫沉淀三R亚型III型InsP水平三Rs在“no-ip”通道中通过Western blotting显示。（D） Bcl-2和InsP三如前所述，从B17克隆中免疫沉淀Rs，并使用SERCA3抗体通过Western blotting分析免疫沉淀。B17细胞中SERCA3的水平显示在“无ip”通道中。（E） 内源性小鼠Bcl-2和InsP三使用小鼠Bcl-2特异性抗体和与所有三种InsP亚型反应的抗体从S49.A2细胞中免疫沉淀Rs三分别为卢比。在所有小组中，标有“IgG”的通道代表使用非特异性IgG控制抗体进行的免疫沉淀。InsP公司三使用III型InsP抗体在Bcl-2免疫沉淀物中检测到Rs三Rs（左），InsP中检测到内源性Bcl-2三用小鼠Bcl-2抗体探测Western blots，获得R免疫沉淀物（右）。（F） Bcl-2和InsP三如前所述，从S49A2细胞中免疫沉淀Rs，并使用SERCA3抗体通过Western blotting分析免疫沉淀。S49A2小区中SERCA3的水平显示在“无ip”通道中。
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参考文献

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