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.2004年8月；24(15):6710-8.
doi:10.128/MCB.24.15.6710-6718.2004。

mTOR对早期小鼠胚胎和胚胎干细胞的生长和增殖至关重要

村上春美 1, 一中友子, 前田光世, 诺里科·大弘（Noriko Oshiro）, 肯塔·哈拉, 弗兰克·艾登霍夫, 木山浩史, 川端康成（Kazuyoshi Yonezawa）, 山中伸也
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mTOR对小鼠早期胚胎和胚胎干细胞的生长和增殖至关重要

村上春美等人。 分子细胞生物学. 2004年8月.

摘要

TOR是一种丝氨酸-三氢嘌呤激酶，最初被确定为酿酒酵母中雷帕霉素的靶标，后来发现在真核生物中高度保守。在果蝇中，TOR或其底物S6激酶失活会导致细胞尺寸减小和胚胎死亡率降低，表明TOR途径在细胞生长控制中起着关键作用。然而，哺乳动物TOR（mTOR）的体内功能尚不清楚。在本研究中，我们通过同源重组破坏了小鼠mTOR的激酶结构域。虽然杂合突变小鼠正常且可生育，但纯合子突变胚胎在植入后不久因胚胎和胚外细胞增殖受损而死亡。纯合子囊胚看起来正常，但其内细胞团和滋养层在体外未能增殖。mTOR的C-末端六种氨基酸对激酶活性至关重要，其缺失会导致胚胎干细胞的细胞尺寸减小和增殖停滞。这些数据表明，mTOR控制早期小鼠胚胎和胚胎干细胞的细胞大小和增殖。

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图1。
图1。
mTOR的表达谱。（A） 通过Northern blot检测ES细胞和12只成年小鼠组织中mTOR转录物的表达水平。（B） 如前所述，通过蛋白质印迹分析测定人胚胎肾（HEK）细胞和ES细胞中的mTOR蛋白水平（16）。CDK4被用作加载控制。
图2。
图2。
有针对性地破坏小鼠mTOR公司基因。（A） 我们构建了一个靶向载体，用IRES-β基因盒替换外显子44至47。显示了限制性内切酶位点（E，EcoRI；K，KpnI）的位置和用于Southern blot分析的探针。与激酶结构域相对应的外显子显示为黑框。箭头表示PCR使用的引物。（B） Southern blot和PCR分析。实心箭头表示对应于野生型基因座的条带，而开放箭头则表示对应于目标基因座的带。WT，野生型ES细胞；+/-，杂合突变ES细胞。（C） Northern blot分析表明，除了野生型转录物外，靶细胞还表达了更大的转录物，对应于mTOR和βgeo的融合。（D） 蛋白质印迹分析。如前所述测定mTOR、4E-BP1和CDK4的蛋白质水平（16）。
图3。
图3。
胚胎致死性mTOR公司突变体。（A） 受精后6.5天解剖胚胎。（B和C）石蜡包埋胚胎在生后6.5天（B）和生后7.5天（C）的苏木精和伊红染色切片。括号中显示了形态正常和变异（异常）的胚胎数量。
图4。
图4。
mTOR在囊胚增殖中的作用。（A） 在受精后3.5天从杂合杂交中收集胚胎，并通过PCR进行基因分型。显示了具有代表性的野生型（+/+）和纯合突变型（−/−）胚胎。（B） 野生型和纯合型突变囊胚在涂有明胶的培养皿中培养7天。（C） 用雷帕霉素（200 nM）体外培养野生型囊胚7天。
图5：。
图5：。
ES细胞中mTOR末端C端的条件性缺失。（A） 3′终点mTOR公司显示了基因、靶向载体和正确靶向的突变基因座。后两个序列中的实心三角形表示液氧磷地点。星号表示mTOR的翻译终止密码子。还显示了限制性内切酶位点（B，BamH；H，HindIII）和Southern blotting探针的位置以及PCR引物（箭头）的位置。（B） Southern blot和PCR分析。实心箭头表示与野生型基因座相对应的条带，而空心箭头表示与目标基因座相对应的条带。野生型ES细胞；Flox/+，杂合靶向ES细胞；Flox/Flox，纯合靶向ES细胞。（C） Northern印迹分析。（D） Western blot分析显示mTOR、4E-BP1和CDK4的蛋白质水平。
图6。
图6。
ES细胞中mTOR失活的影响。（A） mTOR公司弗洛克斯/弗洛克斯用由组氨酸标签、Tat肽、猴病毒40核定位信号和Cre重组酶（HTNC）或PBS组成的重组融合蛋白处理ES细胞和野生型ES细胞。在HTNC处理后24、48和72 h用Western blot检测mTOR、4E-BP1和CDK4的蛋白水平。（B） 每24小时计数一次细胞数。（C）用雷帕霉素（20 nM）或溶剂（乙醇）处理野生型ES细胞指定时间，并计数细胞数。（D和E）通过流式细胞术分析面板B和C中的细胞来确定细胞周期分布在HTNC处理后的指定时间点，通过PCR评估C介导的漂浮片段缺失。箭头表示用于PCR分析的引物。Del表示经过Cre介导的floxed区域缺失的位点。星号表示翻译终止密码子。
图7。
图7。
FKBP12在ES细胞中的表达。（A） 通过Northern blot分析确定FKBP12转录物的组织分布。（B） Northern blot分析证实FKBP12在MG1.19 ES细胞中的转基因表达。开放箭头表示转基因表达，而实心箭头表示内源性表达。作为阴性对照，用亲本质粒（模拟）转染细胞。（C） 雷帕霉素（20 nM）对转染亲本质粒（模拟）和FKBP12表达质粒的细胞增殖的影响。
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    1. Brown，E.J.、M.W.Albers、T.B.Shin、K.Ichikawa、C.T.Keith、W.S.Lane和S.L.Schreiber。G1-雷帕霉素受体复合物靶向的哺乳动物蛋白。自然369:756-758。-公共医学
    1. Brown，E.J.、P.A.Beal、C.T.Keith、J.Chen、T.B.Shin和S.L.Schreiber。1995年。通过体内FRAP的激酶活性控制p70 s6激酶。自然377:441-446。-公共医学
    1. Brunn、G.J.、C.C.Hudson、A.Sekulic、J.M.Williams、H.Hosoi、P.J.Houghton、J.C.Lawrence，Jr.和R.T.Abraham。1997年。哺乳动物雷帕霉素靶点对翻译阻遏物PHAS-I的磷酸化。科学277:99-101。-公共医学
    1. 伯内特、P.E.、R.K.巴罗、N.A.科恩、S.H.斯奈德和D.M.萨巴蒂尼。1998。翻译调节因子p70 S6激酶和4E-BP1的RAFT 1磷酸化。程序。国家。阿卡德。科学。美国95:1432-1437。-项目管理咨询公司-公共医学

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