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.2004年8月；24(15):6592-607.
doi:10.1128/MCB.24.15.6592-6607.2004。

凋亡过程中活性caspase 8与线粒体膜的关联：在足叶乙甙诱导细胞死亡中切割BAP31和caspase 3以及介导线粒体内质网串扰的潜在作用

Dhyan Chandra公司 1, 格雷斯·蔡, 小弟邓, 鲍比·巴蒂亚, 彼得·丹尼尔, 院长G Tang
附属公司

凋亡过程中活性caspase 8与线粒体膜的关联：在足叶乙甙诱导细胞死亡中切割BAP31和caspase 3以及介导线粒体内质网串扰的潜在作用

迪扬·钱德拉等。 分子细胞生物学. 2004年8月.

摘要

最近的研究表明，在细胞凋亡过程中，活性caspase 9和caspase 3迅速积聚在富含线粒体的膜部分（D.Chandra和D.G.Tang，J.Biol.Chem.278:17408-17420，2003）。我们现在发现，活性caspase 8也与多种刺激引起的细胞凋亡膜相关。分馏研究表明，在用足叶乙甙（VP16）处理的MDA-MB231乳腺癌细胞中，活性caspase 8仅在含有线粒体和内质网（ER）的膜组分中检测到。然而，免疫荧光显微镜显示，原胱天蛋白酶8和活性胱天蛋白酶8主要与线粒体共定位。生化分析表明，原胱天蛋白酶8和活性胱天蛋白酶8主要作为整合蛋白定位在线粒体外膜（OMM）上。显性阴性突变体、小干扰RNA、肽抑制剂和Fas相关死亡域（FADD）的功能分析-caspase 8缺陷的Jurkat T细胞证实，线粒体定位的活性caspase 8主要来源于FADD依赖性和肿瘤坏死因子受体相关的死亡域依赖性机制，caspase 9的激活在VP16诱导的caspase 3激活和细胞死亡中起因果作用。最后，我们证明OMM定位的活性caspase 8可以激活胞浆caspase 3和ER-localized BAP31。BAP31的裂解导致产生内质网定位的促凋亡BAP20，其可能通过钙依赖机制介导线粒体-内质网串扰。

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数字

图1。
图1。
活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8仅与膜部分相关。（A） 收集经VP16处理的MDA-MB231细胞，以指定的时间间隔制备膜（即10000×克颗粒）和细胞溶质（即S100）组分，用于所示分子的Western blotting。在这些实验中，将35μg胞浆或60μg膜加载到每条通道中。显示了蛋白酶及其相应的裂解产物。数据代表了三到四次重复实验的结果。在B组中，按照A组所述进行细胞分馏和Western blotting。还使用细胞溶胶和膜组分测量caspase 9（LEHDase）、caspase 3/7（DEVDase）或caspase 8（IETDase）活性。数据代表了两到三次重复实验的结果。抗细胞色素检测到的X蛋白c（c）抗体（9,10）作为膜组分的负荷控制。细胞色素cc（c）请注意，在本图和以下所有图中，使用多克隆抗caspase 8抗体检测到了procasase 8（Procasp-8），而使用单克隆抗caspase 8抗体则检测到了p20和p18条带。
图2。
图2。
多个凋亡系统中活性caspase 8与膜组分的关联。（A） 在指定的时间间隔内，用VP16处理LNCaP细胞。在治疗结束时，收集、分离细胞，并用于蛋白质印迹和活性测量，如图1图例所示。（B至D）用经血清饥饿处理的LNCaP细胞（B）或经BMD188（C）或STS（D）处理的GM701成纤维细胞制备的细胞溶胶和膜组分来测量caspase活性或在caspase 8的Western blotting中。数据代表了两到三次重复实验的结果。普鲁卡司，普鲁卡司。
图3。
图3。
活性半胱天冬酶8与线粒体ER富集膜的关联。（A） 从对照（Cont）或VP16处理（10μM，72 h）MDA-MB231细胞制备的细胞溶胶（Cytol）或蔗糖梯度纯化膜（Memb）用于所示分子的Western blotting（60μg/lane）或caspase活性测量。（B） 将膜或微粒体部分用于所示分子的Western blotting（60μg/lane）。数据代表了至少两次重复实验的结果。Procasp、procaspase。
图4。
图4。
半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8定位于MDA-MB231细胞的线粒体。（A至C）用单克隆抗caspase 8抗体（A）单独染色caspase八（C8），用Mitoracker红CMXRos（B）染色线粒体（Mito），或用兔抗BAP31抗体（C）染色ER（BAP31）。（D到O）未经处理的MDA-MB231细胞（D到F和J到L）或经VP16处理的细胞（10μM，48 h）（G到I和M到O）被双重标记为caspase 8（D、G、J和M）和线粒体（E和h）或ER（K和N）。面板F、I、L和O中的显微照片分别是覆盖图（两者）。图I和图O中的插图描绘了箭头标记的细胞的凋亡细胞核。面板D和E中的箭头显示了caspase 8、线粒体和ER沿细胞骨架的明显分布模式。原始放大倍数，×400。注意，在图D至F和图J至L中，显示了几个分布良好的细胞，以清楚地揭示共定位。所示的显微照片代表了500多张分析过的图像。
图5：。
图5：。
半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8主要定位在OMM上，不被半胱氨酸蛋白酶3激活。（A） procaspase 8（Procasp-8）和活性caspase 8都位于OMM上。从对照（Cont）或VP16（10μM）刺激的MDA-MB231细胞制备的膜组分用蛋白酶K（pro-K）单独或蛋白酶K加Triton X-100处理，然后用于所示分子的Western blotting。（B） 从VP16处理过的MDA-MB231细胞（10μM，72 h）中纯化的线粒体膜经过碱处理或高盐提取。最后，对样品进行离心分离，收集颗粒（P）或上清液（S），并用于所示分子的Western blotting。塞浦路斯。c、 细胞色素c（c）活性caspase 3不激活MDA-MB231细胞中的caspase 8。用未经处理的MDA-MB231细胞制备的100微克未经溶解或用NP-40（最终浓度为1%，用星号表示）溶解的细胞质（Cyto）或细胞膜（Memb），在不含或不含DEVD-CHO（10μM）的情况下，在总体积为100μl的条件下，用重组活性caspase 3（C3）（1μM）进行培养；37°C持续4小时）。培养结束时，将样品（每个40μl）用于caspase 8或caspase 9的Western blotting。数据代表了两到三次重复实验的结果。
图6。
图6。
在VP16诱导的MDA-MB231细胞死亡中，半胱天冬酶8的FADD/TRADD依赖性激活和半胱天苷酶8的关键作用。（A到C）DN-FADD和DN-TRADD抑制caspase激活。用DN-FADD或DN-TRADD转染的对数期MDA-MB231细胞用VP16（10μM，48小时）处理。全细胞裂解物用于测量caspase活性，详见材料和方法。绿色荧光蛋白载体的转染显示，转染效率为20至25%。数据表示平均值±标准偏差。*，P（P）<0.05（学生的t吨测试）。（D） DN-FADD和DN-TRADD抑制VP16诱导的caspase 3激活和凋亡。用DN-FADD或DN-TRADD转染对数期MDA-MB231细胞。24小时后，用VP16处理细胞48小时。最后，用全细胞裂解物（60μg/lane）对caspase 3进行Western blotting。DAPI染色定量细胞凋亡。（E） DN caspase 9或DN caspase 8抑制VP16诱导的caspase 3激活和凋亡。在不同条件下处理的MDA-MB231细胞制备的全细胞裂解物（60μg/lane）（如面板D）用于caspase 3的Western blotting。细胞凋亡通过DAPI染色进行定量。星号表示非特定带。（F） 用caspase 8（C8-1和C8-2）或打乱siRNA（C8-S）的两个siRNA转染LNCaP细胞。转染24小时后，用VP16（10μM，48小时）处理细胞。在治疗结束时，对细胞凋亡进行量化，并使用全细胞裂解物（60μg/lane）进行Western blotting。（G） 野生型，FADD−/−或半胱天冬酶8−/−用VP16（1μM）处理12或24小时的Jurkat细胞用于制备膜和胞质溶胶部分。在所示分子的Western blotting中使用等量的蛋白质（60μg/lane）。利用50μg胞浆和膜组分测定半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性。按照材料和方法中的描述，测定细胞凋亡的百分比。控制；Procasp，procaspase；WT，野生型。
图7。
图7。
活性caspase 8可降解caspase 3和BAP31。（A和B）重组活性半胱天冬酶8的无细胞实验。在A组中，将100μg细胞质（细胞）（1至2道）或膜（Memb）（3至6道）与重组活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8（C8）（2μM）或单独缓冲液在37°C下以100μl的总体积孵育4小时。对于通道3至6，在培养结束时离心样品，以获得上清液（S）和颗粒（P）。然后将颗粒重新悬浮在100μl TNC缓冲液中。所有样品（40μl/lane）用于半胱天冬酶9或3的Western blotting。（B） 除了在通道4至通道6中用含有NP-40的TNC缓冲液溶解膜外，实验按面板A所述进行。在培养结束时，一半样品被离心以获得上清液和颗粒，另一半（混合物）直接用于蛋白质印迹。在车道3中，DEVD-fmk的使用温度为10μM。（C） VP16活化膜的无细胞实验。在不存在或存在10μM IETD fmk或DEVD fmk的情况下，将来自VP16处理的（10μM用于48）MDA-MB231细胞的100微克膜级分（未裂解或裂解（星号表示））与100μg未处理的胞质溶胶在37°C下孵育4小时。在培养结束时，直接在半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9的Western blotting中使用等量的蛋白质（40μg/lane）。（D） 从VP16刺激的（10μM持续72小时）MDA-MB231细胞中分离的膜部分裂解BAP31。将10k上清液和VP16活化的膜组分各100微克单独培养或混合培养（37°C下4小时）。培养结束后，对样品进行离心，以获得上清液（Super.）或颗粒。然后在BAP31的Western blotting中使用等量的蛋白质（40μg/lane）。对于3号和6号车道，添加了最终浓度为1%的NP-40（用星号表示）。箭头表示p27 BAP蛋白。+，存在；−，不存在。（E） 培养的人类细胞中caspase 8L表达水平低。用多克隆胱天蛋白酶8L特异性抗体对胱天蛋白酶8进行蛋白质印迹，使用等量的从小鼠胸腺或所示细胞制备的全细胞裂解物（100μg/泳道）。重新检测肌动蛋白的印迹。（F） Caspase 8L不参与VP16诱导的BAP31分裂或凋亡。MDA-MB231细胞未经转染（对照）或转染DN caspase 8L构建物（Nex-EGFP）。将全细胞裂解物（60μg/ml）用于所示分子的Western blotting。用多克隆抗绿色荧光蛋白载体检测Nex-EGFP。负载控制是由抗绿色荧光蛋白抗体检测到的非特异性带。星号表示由抗胱天蛋白酶3抗体检测到的非特异性条带。Procasp、procaspase。
图8。
图8。
VP16诱导细胞凋亡中潜在的线粒体-内质网串扰。（A） BAP31优先在与线粒体共分馏的内质网细胞群中被裂解。使用经载体处理或VP16处理的MDA-MB231细胞获得所示的各种组分。在所示分子的Western blotting中使用等量的蛋白质（40μg/lane）。显示了BAP31的两种不同暴露（即短期和长期暴露）。注意，为了简单起见，只显示了VDAC-OMM。膜，膜；WCL，全细胞裂解物。（B） 内质网钙耗尽2+储存或抑制线粒体对钙的摄取2+抑制VP16诱导的细胞凋亡。用载体（乙醇）或50 nM TG或50μM Ru360预处理MDA-MB231细胞1 h。去除这些化学物质后，用VP16（10μM）处理细胞48 h。处理结束后，用DAPI染色对细胞凋亡进行评分。平均而言，每种情况下都计算了250到400个细胞，数据代表平均值±标准偏差。*，P（P）<0.01（学生的t吨测试）。（C） VP16诱导细胞凋亡过程中的线粒体断裂。用VP16（10μM，48 h）处理MDA-MB231细胞，用Mitotracker和DAPI标记活细胞。箭头表示DAPI阳性（即凋亡）细胞，显示线粒体碎片。所示的显微照片代表了所分析的约400个图像。
图9：。
图9：。
图示了足叶乙甙刺激MDA-MB231细胞后的凋亡信号通路。详见正文。casp、caspase；塞浦路斯。c、 细胞色素c（c）.
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