A chromosomal memory triggered by Xist regulates histone methylation in X inactivation

doi:10.1371/journal.pbio.0020171

.2004年7月；2（7）：E171。

doi:10.1371/journal.pbio.0020171。 Epub 2004年7月13日。

Xist触发的染色体记忆调节X失活组蛋白甲基化

亚历山大·科尔迈尔¹, 法比奥·萨瓦雷斯, 莫妮卡·拉赫纳, 乔斯特·马滕斯, 托马斯·杰努韦恩, 安东·沃茨

附属公司

PMID： 15252442
预防性维修识别码：项目经理449785
内政部： 10.1371/期刊.pbio.0020171

Xist触发的染色体记忆调节X失活组蛋白甲基化

亚历山大·科尔迈尔等。公共科学图书馆生物. 2004年7月.

.2004年7月；2（7）：E171。

doi:10.1371/journal.pbio.0020171。 Epub 2004年7月13日。

作者

亚历山大·科尔迈尔¹, 法比奥·萨瓦雷斯, 莫妮卡·拉赫纳, 乔斯特·马滕斯, 托马斯·杰努韦恩, 安东·沃茨

附属

¹奥地利维也纳分子病理学研究所。

PMID： 15252442
预防性维修识别码：第49785页
内政部： 10.1371/日志.pbio.0020171

摘要

我们利用小鼠胚胎干细胞中可诱导的Xist表达系统阐明了X失活期间组蛋白甲基化的动力学。以前的报告显示，Xist触发沉默的能力仅限于ES细胞分化的早期窗口。在这里，我们表明这个窗口对于在潜在的非活性X染色体上建立甲基化模式也很重要。通过免疫荧光和染色质免疫沉淀实验，我们发现组蛋白H3赖氨酸27三甲化（H3K27m3）和H4赖氨酸20单甲基化（H4K20m1）与未分化ES细胞中的Xist表达相关，并标志着X失活的开始。这两个标记都依赖于Xist RNA定位，但与沉默无关。在起始窗口之后诱导Xist表达会导致诱导H3K27m3的能力显著降低，而在限制时间点之前的表达则允许高效建立H3K27 m3。我们的数据表明，Xist在ES细胞分化早期的表达建立了染色体记忆，在没有沉默的情况下保持这种记忆。这种记忆的一个结果是能够在Xist早期表达的染色体上的限制时间点之后有效地引入H3K27m3。我们的结果表明，这种沉默无关的染色体记忆对X失活的维持具有重要意义，之前自我维持的异染色质结构被视为记忆的主要形式。

PubMed免责声明

利益冲突声明

提交人声明，不存在利益冲突。

数字

**图1。X失活起始时的表观遗传印记**
（A–H）对未分化克隆36 ES细胞经3天后制备的有丝分裂染色体进行间接免疫荧光和后续DNA FISH分析*西斯特*归纳。异位时，H3K27m3（A）、H4K20m1（B）和Ezh2（D）富集在11号染色体臂上*西斯特*表达。H3K9m2（C）未增强*西斯特*表达。H3K4m2（E）在11号染色体上减少*西斯特*诱导（绿色方框），并且不存在着丝粒周围异染色质和Y染色体（橙色箭头）。（F）组蛋白H4多赖氨酸乙酰化部分减少（绿色方框，左侧面板）。低乙酰化（红色）仅限于H3-K27三甲基化水平较高的染色体区域（绿色，右侧面板）。H3K9m3（G）和H3K27m1（H）在中心周围区域和Y（橙色箭头）的组成异染色质处富集。（I–K）间接免疫荧光（上面板）和后续*西斯特*RNA FISH（红色，*西斯特*RNA；蓝色，DAPI）分析未分化克隆36 ES细胞间期细胞核中H3K27m3（I）、H4K20m1（J）和Ezh2（K）的表达*西斯特*持续3天。

**图2。H3K27m3、H4K20m1、H3K9m2、H3K4m3和H3K4m2的ChIP映射*西斯特*-克隆36 ES细胞分化过程中11号染色体的表达**
左边是第11号染色体的遗传图，显示了所分析的位点(*西斯特*-TG，近似积分位置*西斯特*转基因；*嘌呤，PGK嘌呤霉素*标记）。（A至F）染色质是从未分化的克隆36 ES细胞中制备的，该细胞在多西环素存在（浅色条）或不存在（深色条）的情况下生长3d。H3K27m3和H4K20m1在18.0（A）、45.5（C）和75.2（D）cM的三个基因间微卫星序列中富集*PGK嘌呤霉素*在强力霉素诱导的细胞中，伴随着H3K4m2和H3K6m3的丢失。（E） Tubulin对照。（F）控制微卫星位于第15号染色体上。（G–L）克隆36 ES细胞中H3K27m3、H4K20m1和H3K9m2的分析，用强力霉素（浅色条）或不使用强力霉素的（深色条）分化9d。监测组蛋白甲基化标记。实验重复进行，并在图表中显示标准误差。

**图3。的序列*西斯特*H3K27m3建立所需的RNA**
（A）的示意图*西斯特*cDNA（顶部）表示重复序列A到E、限制位点和相对于定位所需序列位置的缺失位置（彩色条）（黑色和阴影框；Wutz等人，2002年）。（B） 3天后未分化ES细胞中期染色体扩散的H3K27m3分析*西斯特*归纳法（见正文）。染色模式(n个>100）分为染色体宽密集甲基化（黑色）、甲基化降低（灰色）和单带（开放）。（C）不同触发H3K27m3的模式*西斯特*诱导3d后中期染色体上的突变体。11号染色体（克隆36）或X染色体（T20系，J1敲入系）的放大图。（D）间期细胞核局部H3K27m3染色（给出百分比；n个>100）未分化ES细胞表达*西斯特*构造。

**图4。H3K27m3建立的限制和分化中的转录沉默**
（A）克隆36 ES细胞分化过程中H3K27m3的启动。*西斯特*在分化开始时（+）或分化开始后的不同时间点（24～120h）诱导表达，或不诱导表达（−）。显示H3K27m3（黑色条；n个>700）和Ezh2（灰色条；n个>200）染色。（B）分化过程中转录沉默的启动通过Northern印迹分析来评估*PGK嘌呤霉素（puro）*和*Gapd公司*作为并行文化中的加载控件，如（a）所述。（C）维甲酸诱导克隆36 ES细胞分化过程中Ezh2和Eed蛋白水平的Western分析。组蛋白H3和H4用作负荷对照。（D）在胚胎发育期间建立H3K27m3。*西斯特*从雄性Xist-tetOP胚胎（见正文）的单个X染色体诱导表达3 d（E9.5-12.5和E13.5-16.5）。H3K27m3染色的细胞在间期（左侧）和细胞簇中的百分比*西斯特*RNA（右，开条）已给出(n个> 300). 灰色区域表示H3K27m3阳性细胞与*西斯特*-阳性细胞。（E）*西斯特*（C）中描述的胚胎颈部结缔组织制备的组织切片的RNA FISH（顶部）和H3K27m3（底部）染色。

**图5。H3K27m3稳定性动力学研究**
（A）相间核百分比(n个>100）显示H3K27m3染色和*西斯特*分析未分化克隆36 ES细胞的RNA，该克隆表达*西斯特*（B）显示了（A）中分析的时间点的代表性图像。（C） H3K27m3在分化克隆36 ES细胞中的可逆性。H3K27m3染色的间期细胞百分比(n个>100）用于在强力霉素（+）存在下分化4d的细胞，或在没有诱导剂的情况下进一步分化48,72或96h的细胞。

**图6。早期*西斯特*表达对染色体记忆的影响与沉默无关**
转基因*西斯特*11号染色体在克隆36 ES细胞（黑条）或沉默缺陷细胞中诱导表达*西斯特*来自J1中X的RNA：XistΔSX-tetOP ES细胞（开条）分化过程中的时间点（见正文）。绘制H3K27m3染色的细胞百分比(n个> 250). 下面是一个方案*西斯特*归纳法适用于所有文化，箭头表示分析时间。

**图7。ES细胞分化过程中染色体记忆的建立**
（A）在存在强力霉素（第1道）或不存在诱导剂（第2道）的情况下，克隆36 ES细胞分化13天，并测定H3K27m3染色的细胞百分比(n个> 800). 在分化开始时，平行培养物要么没有*西斯特*诱导（第3车道）或脉冲强力霉素24小时（第4车道）、36小时（第5车道）、48小时（第6车道）、60小时（第7车道）或72小时（第8车道），然后退出诱导剂并协调延迟诱导，从第8天到第13天。红色虚线表示染色体记忆恢复时的24小时转换间隔。（B和C）分化过程中不可逆转录沉默的建立。（B）由以下原因引起的11号染色体异位失活*西斯特*通过Northern blot分析评估克隆36 ES细胞的诱导分化作用*PGK嘌呤霉素（嘌呤）*和*Gapd公司*作为加载控件。车道通过电子方式对齐，以提高可读性。在多西环素（1号通道）或无诱导剂（2号通道）的情况下，ES细胞分化13天。在分化开始时，平行文化接受*西斯特*脉冲24、36、48或60小时，然后在剩余时间（3至7道）内撤回诱导剂，或随后再次诱导*西斯特*分化第8天（第8至11车道）。在分化第13天对所有细胞进行分析。（C）定量*[希神]普洛*表达式相对于*Gapd公司*使用tnimage软件从两个独立的Northern印迹中导出。红色虚线表示发生从可逆到不可逆沉默转变的24小时间隔。

**图8。X灭活从启动到维持的过渡模型**
X失活的阶段与ES细胞分化的天数有关（底部）。（A）在未分化的ES细胞中，有效的染色体宽度H3K27m3依赖于这两种*西斯特*染色体RNA定位顺式通过A重复序列（黑色三角形）启动转录沉默。（B）在分化早期，对于高水平H3K27m3（虚线箭头），沉默是必不可少的。（C）关键窗口的开始在*西斯特*失去触发H3K27m3（虚线箭头）和转录沉默的潜力。关键窗口是通过维持高水平的H3K27m3来协商的，这被认为与*西斯特*RNA——染色体记忆募集的信号（黑色椭圆形）。当沉默变得不可逆转时，记忆就建立在习身上*西斯特*独立。（D）在X失活的维持阶段，染色体记忆允许*西斯特*RNA有效建立H3K27m3。

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