Silent information regulator 2 potentiates Foxo1-mediated transcription through its deacetylase activity

doi:10.1073/pnas.0400593101

.2004年7月6日；101(27):10042-7.

doi:10.1073/pnas.0400593101。 Epub 2004年6月25日。

沉默信息调节器2通过其去乙酰化酶活性增强Foxo1介导的转录

Hiroaki Daitoku公司¹, Mitsutoki Hatta公司, 松崎喜美, 佐藤·阿拉塔尼, 大岛县Takayuki, 宫城真人, 中岛俊弘, 福田昭史

附属公司

PMID： 15220471
预防性维修识别码：项目经理454161
内政部： 10.1073/pnas.0400593101

沉默信息调节器2通过其去乙酰化酶活性增强Foxo1介导的转录

Hiroaki Daitoku公司等。美国国家科学院程序. 2004.

.2004年7月6日；101(27):10042-7.

doi:10.1073/pnas.0400593101。 Epub 2004年6月25日。

作者

Hiroaki Daitoku公司¹, Mitsutoki Hatta公司, 松崎喜美, 佐藤·阿拉塔尼, 大岛县Takayuki, 宫城真人, 中岛俊弘, 福田昭史

附属

¹筑波大学筑波高级研究联盟中心，日本茨城县筑波市Ten-noudai 1-1-1号，邮编305-8577。

PMID： 15220471
预防性维修识别码：项目经理454161
内政部： 10.1073/pnas.0400593101

摘要

长寿调节基因包括Forkhead转录因子FOXO和NAD依赖的组蛋白去乙酰化酶沉默信息调节器2（Sir2）。遗传研究表明，Sir2在FOXO家族成员DAF-16上游的秀丽隐杆线虫胰岛素样信号通路中起到延长寿命的作用。然而，在Sir2介导的寿命中DAF-16活性需求的分子机制尚不清楚。在这里，我们显示Foxo1（也称为FKHR）的可逆乙酰化，即小鼠DAF-16同源物，调节其反式激活功能。cAMP响应元件结合蛋白（CREB）结合蛋白在K242、K245和K262残基上结合并乙酰化Foxo1，其修饰涉及FoxoI作为转录因子的衰减。相反，Sir2在cAMP响应元件结合蛋白结合蛋白乙酰化的残基上结合并去乙酰化Foxo1。Sir2被招募到胰岛素应答序列相关启动子，并以脱乙酰酶活性依赖的方式增加锰超氧化物歧化酶和p27（kip1）的表达。我们的发现将Foxo1确立为哺乳动物系统中Sir2的直接功能靶点。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
CBP结合并乙酰化Foxo1。(A类)内源性CBP与Foxo1的相互作用。用抗Foxo1或抗CBP抗体免疫沉淀（IP）并用Western blotting（WB）分析血清饥饿HepG2细胞的细胞提取物。输入通道占用于结合分析的全细胞提取物总体积的5%。(B)体外CBP和Foxo1的相互作用。将转染HA-CBP WT的HEK293T细胞的细胞提取物与GST或各种GST-Foxo1缺失突变体孵育。(C类)Foxo1由CBP乙酰化。用抗FLAG抗体免疫沉淀转染指示质粒的HEK293T细胞的细胞提取物，并用抗乙酰化赖氨酸或抗FLAG的抗体进行探测。Western blotting显示细胞提取物中CBP-HA的表达。(D类–*G公司*)Foxo1乙酰化位点的鉴定。Foxo1缺失突变体的示意图如所示D类箭头所示的GST-Foxo1蛋白体外用免疫沉淀CBP进行乙酰化分析。反应产物通过考马斯亮蓝染色和放射自显影术进行分析(¹⁴C）。星号表示自动乙酰化的CBP。(*H（H）*)抗乙酰化Foxo1（K242/K245）抗体特异性识别Foxo中的乙酰化K242和K245残基。将GST-FHD WT或-FHD 2KA（KK242245AA）蛋白与GST-CBP（HAT）蛋白在乙酰辅酶A（0.1mM）存在或不存在下孵育，然后用抗乙酰化Foxo1（K242/K245）抗体进行免疫印迹，并用胭脂红-S溶液染色。

**图2。**
CBP通过其在染色体报告子上的乙酰转移酶活性调节Foxo1介导的转录。(A类)CBP乙酰转移酶活性对Foxo1介导的转录的影响。将Foxo1与CBP WT或CBPΔHAT联合转染FK-1细胞，检测荧光素酶活性。(B)KR突变改变Foxo1反式激活功能。用所示的Foxo1突变体转染FK-1细胞，并测定荧光素酶活性。(下部)Western blotting检测到等量的FLAG-Foxo1蛋白。(C类)CBP协同激活Foxo1 WT和3KR。将Foxo1 WT（黑盒）或3KR（灰盒）与CBP一起转染FK-1细胞，荧光素酶活性表现为Foxo1-WT或3KR单独获得的活性的折叠诱导。

**图3。**
Sir2结合Foxo1并使其脱乙酰。(A类)内源性Sir2和Foxo1的相互作用。HepG2细胞与抗Foxo1抗体共免疫沉淀（IP）。输入通道占用于结合分析的全细胞提取物总体积的5%。WB，Western blotting。(B)Sir2和Foxo1之间的关联体外将转染HA-Sir2的HEK293T细胞的细胞提取物与GST或各种GST-Foxo1缺失突变体孵育。(C类和D类)Sir2脱乙酰基Foxo1体外.乙酰化GST-Foxo1（FHD）(C类)或（C1）(D类)蛋白质与免疫沉淀Sir2孵育。如图所示添加NAD（50μM）、NIA（5 mM）和/或曲古抑菌素A（TSA，1μM），并通过Western blotting分析反应(上部)和Ponceau-S染色(下部). (E类)Sir2脱乙酰基Foxo1体内HEK293T细胞的细胞提取物用FLAG-Foxo1、HA-CBP、HA-Sir2 WT或HA-Sir2 H355A转染，如所示，并通过免疫沉淀和蛋白质印迹进行分析。

**图4。**
Sir2共同激活Foxo1介导的转录。(A类)Sir2和CBP在染色质环境中促进Foxo1转录。如图所示，用空载体或Foxo1 WT转染FK-1细胞，同时转染或不转染Sir2和/或CBP，并测量荧光素酶活性。(B)Sir2通过其脱乙酰酶活性增强GAL4-Foxo1介导的转录。如图所示，将GM-1细胞与GAL4-Foxo1以及Sir2-WT或H355A共同转染。(C类)招募Foxo1、CBP和Sir2加入*锰超氧化物歧化酶*和*第27页*^基普1发起人。用HEK293细胞中的指示抗体进行染色质免疫沉淀分析。免疫沉淀（IP）DNA用特异性引物集进行PCR分析。(D类)NIA降低Foxo1介导的基因表达。用NIA（0、5和10 mM）在无血清条件下处理HEK293细胞24小时。(E类)Sir2的过度表达影响Foxo1介导的基因表达。将稳定转染Sir2 WT或Sir2 H355A的HEK293细胞与10%FBS或胰岛素（100 nM）混合培养18 h。

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