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.2004年7月；24(13):5923-36.
doi:10.1128/MCB.24.13.5923-5936.2004。

染色质免疫沉淀法评价糖酵解基因myc E-box系统发育足迹

金正汉 1, 凯伦·泽勒, 王云月, 阿尼尔·G·杰加, 布鲁斯·雅罗诺, 凯瑟琳·奥唐纳, Chi V当
附属公司

染色质免疫沉淀法评价糖酵解基因myc E-box系统发育足迹

金正汉等。 分子细胞生物学. 2004年7月.

摘要

利用系统发育足迹预测基因调控序列已经取得了相当大的进展，但缺乏实验验证。在这里，我们报告了通过点图或基于网络的Trafac分析预测的转录因子结合位点是否可以通过染色质免疫沉淀分析进行验证。MYC过度表达可在不缺氧的情况下促进糖酵解，因此可能有助于改变肿瘤代谢。由于尚不清楚Myc直接调控的糖酵解基因的全谱，我们选择Myc作为模型转录因子，以确定它是否与具有保守典型Myc结合位点或E盒（5'-CACGTG-3'）的目标糖酵化基因结合。ENO1、HK2和LDHA中保守的典型E盒出现在31到111-bp的岛屿上，具有较高的种间序列一致性（>65%）。Trafac分析显示ENO1中的另一个区域与带有非经典E盒的小鼠区域相对应。Myc在人类P493-6 B淋巴细胞中与所有这些保守区域结合良好。我们还确定了Myc是否能结合在剩余人类糖酵解基因中发现的非保守的典型E盒。Myc结合PFKM，但未显著结合GPI、PGK1和PKM2。未检测到绑定到BPGM、PGAM2和PKLR。GAPD和TPI1都不具有保守的E盒，但通过具有非经典E盒的区域被Myc诱导和结合。我们的结果表明，Myc能很好地与保守的规范E盒结合，但不能与非保守的E盒结合。然而，Myc与带有非经典E盒的未预测基因组区域的结合揭示了系统发育足迹的局限性。总之，这些观察结果表明，Myc是糖酵解基因的一个重要调节器，表明Myc在细胞增殖或肿瘤发生过程中向糖酵化代谢的转变中起着关键作用。

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图1。
图1。
人类和小鼠基因组序列中典型E盒的位置和系统发育足迹分析。通过内含子1筛选包含转录起始位点上游5kb的基因组序列，以确定是否存在标准E盒。典型E盒和外显子的位置在人类（每对顶部）和小鼠（每对底部）基因组序列中进行了映射。这些地图显示了进化上保守的典型E盒ENO1公司,香港2号、和LDHA公司基因。使用OMIGA软件的点图特征识别保守的标准E盒。指出了标准E盒及其扩展侧翼区域在30 bp以上的时间内序列一致性超过65%的守恒性。两个序列之间序列同一性的百分比也在映射中指示。保守E盒及其扩展侧翼区域的序列比对如图所示。标准E框在每个序列对齐中装箱。保守核苷酸以粗体显示。用于ChIP分析的扩增区域由人类基因上方的线指示，并在地图中标记为A、B或C。
图2。
图2。
（A） 人类和小鼠糖酵解基因的组织，不包含保守的典型E-box区域。鼠标Gpi公司,Pfkm公司、和Pklr公司基因不包含典型的E盒。标准E盒中或其周围的序列BPGM公司,PFKM公司,PGAM2型,PGK1系列、和PKM2（平方公里）不保守。请注意，大多数鼠标序列Pfkm公司启动子区域不可用。（B） 组织GAPD公司和TPI1型基因。人类GAPD公司和TPI1型基因不包含典型的E盒。为进行ChIP分析而扩增的区域由人类基因上方的标记为A、B或C的线表示。
图3。
图3。
糖酵解基因的Trafac分析（规则图）。与50%以上的同源性一致的系统发育保守区域被表示为不同颜色的区块。在每个保守区域（用不同的颜色表示），共享转录因子结合位点（hits）的数量以及人类和小鼠基因组序列之间的序列一致性百分比以两个独立的线图表示。对于香港2号,LDHA公司和内含子E盒ENO1公司图1图例所示，通过点图分析（OMIGA软件）确定的保守规范E盒在Trafac分析中一致对齐。基因启动子区的两个人类典型E盒ENO1公司对应于同一区域中的小鼠非经典E盒（5′-CACGCG-3′）。使用PGK1系列Trafac分析检测到一个保守的内含子规范E盒。
图4。
图4。
（A） 对未经处理（−）或用四环素（Tet）处理（+）72小时的P493-6细胞中Myc的表达进行Western blot分析。Tubulin在两个面板中均显示为加载控件。
图5：。
图5：。
P493-6细胞系统中糖酵解基因的ChIP分析。显示了糖酵解基因表现出强Myc结合（A）、中等或弱Myc结合性（B）或无Myc结合的（C）。通过实时PCR定量扩增每个基因的标记区域（如图1所示；区域A、B或C）。对未经处理（−）或用四环素（Tet）处理（+）的P493-6细胞沉淀下来的片段染色质进行PCR，处理72小时后使用抗Myc或HGF，无抗体（无Ab），或模拟对照样品，如图底部所示。白色条表示控制区域（区域A）总输入的百分比。黑色和阴影条表示包含保守经典E盒的染色质区域的总输入百分比(ENO1公司,香港2号、和LDHA公司)或非连续规范E盒(BPGM公司,性别均等指数,PFKM公司,PGAM2型,PGK1系列、和PKM2（平方公里）).
图6。
图6。
A1N4细胞系统糖酵解基因的ChIP分析。如图5图例所述，在指定时间用抗Myc抗体或不用抗体（无Ab）从A1N4细胞沉淀的染色质进行实时PCR。
图7。
图7。
人的扫描ChIP分析GAPD公司基因。（A） 人类和小鼠基因组序列中规范E盒、非规范E盒和外显子的位置。小鼠基因中的典型E框用黑色圆圈表示。还显示了非标准E框的前导（+）或补码（−）序列。用于扫描ChIP分析的扩增区域由人类基因上方的线指示，并标记为A到H。（B）人类GAPD公司基因在P493-6细胞系统中通过ChIP分析进行扫描。P493-6细胞未经处理（−Tet）或用四环素（+Tet）处理72小时。如图底部所示，用抗Myc或HGF、无抗体（无Ab）或模拟对照样品进行ChIP。
图8。
图8。
家蚕的系统发育足迹分析和扫描ChIP分析TPI1型（A）非规范E盒和外显子在人类和小鼠基因组序列中显示。还显示了非标准E框的前导（+）或补码（−）序列。小鼠内含子1中的一个标准E框表示为黑色圆圈。虚线区域表示非经典E盒及其扩展侧翼区域的保守性，其序列恒等性超过65%，长度超过30 bp。还显示了序列一致性的百分比。扫描ChIP分析扩增的区域显示为人类基因上方的线，并标记为A到E。（B）显示了保守E盒及其扩展侧翼区域的序列比对。非规范E框在每个序列对齐中都被装箱。保守核苷酸以粗体显示。（C） 人类和小鼠基因组序列的Trafac分析（调节图）。（D） 人的扫描ChIP分析TPI1型在P493-6细胞系统中。P493-6细胞未经处理（−Tet）或四环素处理（+Tet）72小时。如图底部所示，使用抗Myc或HGF、无抗体（无抗体）或模拟对照样品进行ChIP。
图9：。
图9：。
HIF-1和Myc对糖酵解基因网络的调节。HIF-1发出的箭头表示HIF-1对缺氧反应中特定糖酵解基因的调节。从Myc发出的箭头显示为具有不同的厚度。最粗的箭头表示Myc的强大约束力，而虚线箭头表示约束力减弱。HIF-1位于致癌Ras和Src的下游，并受von Hippel-Lindau蛋白（pVHL）负调控。
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