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.2004年6月15日；101(24):8963-8.
doi:10.1073/pnas.0402943101。 Epub 2004年6月7日。

突变层粘连蛋白A的积累导致Hutchinson-Gilford早衰综合征核结构的进行性改变

罗伯特·D·戈德曼 1, 戴尔·K·舒马克, 迈克尔·R·鄂尔多斯, 玛丽亚·埃里克森, 安妮·E·戈德曼, 莱斯利·B·戈登, 约瑟夫·格伦鲍姆, 萨蒂亚·库恩, 梅丽莎·门德斯, 雷内·瓦尔加, 弗朗西斯·柯林斯
附属公司

突变层粘连蛋白A的积累导致Hutchinson-Gilford早衰综合征核结构的进行性改变

罗伯特·D·戈德曼等。 美国国家科学院程序. .

摘要

Hutchinson-Gilford早衰综合征（HGPS）是一种早衰疾病，通常由层粘连蛋白a基因的点突变引起，导致C末端附近缺乏50aa的蛋白质，称为LADelta50。在这里，我们通过光学和电子显微镜显示，HGPS与核形态的显著变化有关，包括核膜分叶、核膜增厚、外周异染色质丢失和核孔聚集。随着培养中HGPS细胞的老化，这些结构缺陷会恶化，其严重程度与LADelta50的明显增加相关。通过转染或蛋白注射将LADelta50导入正常细胞会引起相同的变化。我们假设，核结构的这些改变是由于LADelta50的浓度依赖性显性负效应，导致从维持核形状到调节基因表达和DNA复制的层粘连相关功能中断。

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数字

图1。
图1。
HGPS细胞在培养过程中随着年龄增长核结构的变化。第6代HGPS细胞的典型细胞核(一), 13 (b条)、和26(c（c）)，正常老年人AG09602B(d日)，和包皮成纤维细胞(e（电子）)对照细胞经LA Ab.Nuclei标记后，从第6代到第17代的对照细胞表现类似。第26代HGPS细胞核中的薄层突起或厚度增加(c（c）). 早期通道HGPS(一)和控制细胞核(d日和e（电子）)外观正常。第6代和第26代HGPS细胞被LA双重标记(克和j个)和LB(小时和k个)绝对值。请注意第6段合并图像中染色模式的广泛重合(我)第26代细胞中这种巧合的减少(我). 该表显示，在HGADFN003细胞中，轮廓比作为传代次数的函数而降低。P（P）计算AG09602B成纤维细胞第2代的相关值。在第2代和第17代之间，对照细胞的轮廓比没有显著变化。在用LA/C Abs免疫印迹的HGADFN003全细胞提取物中，在LA（上层带，*)和层粘连蛋白C（下带，*)被观察到，并且随着文章数量的增加而变得更加突出(（f）). （比例尺=5μm）
图2。
图2。
HGPS细胞中核孔和膜的组织。第6代HGPS细胞（HGADFN003；一——c（c）)与对照AG09602B细胞（未显示）非常相似，这是由LA和mAb 414 Abs的双标记间接免疫荧光测定的。沿着核膜的典型点状核孔染色模式很明显。在代表通道24的畸形核中(d日和e（电子）)，如NUP153 Ab检测到的那样，核孔经常聚集成大块。小区域放大视图的比较(c（c）和（f）)表明第26代HGPS细胞的细胞核中气孔分布不均匀(（f）); 中的支架（f）显示了mAb414检测到的基本上不含核孔蛋白的区域。在用emerin Ab染色的HGADFN003细胞中，emerin在所有传代中始终与核膜相关(克和小时). 对照组AG09602细胞在所有传代中Emerin分布均正常(我). [比例尺=5μm(b条,e（电子）、和克——我)和1微米(c（c）和（f）).]
图3。
图3。
前LA在HGPS细胞细胞核中的积聚。在第6代和第13代HGPS细胞中，前LA模式由弱染色的核质灶组成(一和b条)与对照组AG09602B成纤维细胞相似(d日). 然而，到第26代时，LA前染色在分叶细胞核中更加强烈，并且主要与叶片区域有关(c（c）). (e（电子）——克)第26代HGPS HGADFN003细胞的电镜观察(e（电子）和（f）)和正常人包皮成纤维细胞(克). 高倍镜下观察正常人包皮成纤维细胞的核膜，发现核膜附近有一排正常的异染色质，这使得很难检测到任何层结构(克). 第26代HGADFN003细胞核的低倍镜显示广泛的分叶(e（电子）). 第26代细胞的高倍放大图显示外周异染色质的损失和与内核膜相关的显著电子致密薄层区(（f）). 在（f）和克，原子核在左边。[比例尺=5μm(一——e（电子）)和200纳米(（f）和克).]
图4。
图4。
正常细胞中LAΔ50的表达导致细胞核形状迅速改变。(一——c（c）)对照组AG09602成纤维细胞在细胞质内微量注射T7标记的LAΔ50后35分钟，用抗T7标记和抗LA双重标记。在注入活细胞之前，相控显微镜显示细胞核表面光滑，呈正常椭圆形（未显示）。(d日和e（电子）)转染pEGFP-LA-Δ150 48 h后HeLa细胞的高度分叶细胞核(d日)抗LA间接免疫荧光的固定和处理(e（电子）). 在中看到的覆盖（f）表明内源性LA和GFP-LAΔ50存在广泛重叠。转染pEGFP-LAΔ150后活HeLa细胞核膜区的FRAP显示，90分钟后没有检测到恢复(克——我). 盒子在里面克表示光漂白前的感兴趣区域，在插入.漂白后立即显示该区域(小时)漂白后90分钟(我). （比例尺=5μm）
图5。
图5。
HGPS突变对细胞周期不同阶段的影响。固定表达GFP-LAΔ50的有丝分裂HeLa细胞，并用抗LA（红色）进行免疫荧光染色。GFP N端标签显示为绿色。(一)一个处于中期-后期过渡期的细胞显示，由于有丝分裂期间LA的正常分解，LA在细胞质中广泛组织，而GFP-LAΔ50主要见于大的细胞质聚集体。(b条和c（c）)在胞质分裂末期/早期，细胞中仍存在相同类型的聚集物(b条)在G早期子代细胞核重组后1(c（c）). (d日——（f）)HGADFN003细胞用针对增殖细胞核抗原的抗体进行免疫荧光处理。第6代早期可见典型模式的细胞(d日)或中后期(e（电子）)S相，而（f）描述了在第26代含有分叶状核的细胞中检测到的唯一模式。后一种染色与早期S期模式相似。（比例尺=5μm）
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    1. Hutchinson，J.（1886）Medicochir。事务处理。69473–477页。-项目管理咨询公司-公共医学
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