In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes

doi:10.1084/jem.20040139

.2004年6月7日；199(11):1455-65.

doi:10.1084/jem.20040139。

体外扩增抗原特异性调节性T细胞抑制自身免疫性糖尿病

七枝汤¹, 卡米·亨利克森, 毕明英, 埃里克·B·芬格, 格雷格·绍特, 叶建勤, 艾玛·L·马斯特勒, 休·麦克德维特, 马克·邦哈迪, 杰弗里A Bluestone

附属公司

PMID： 15184499
预防性维修识别码：项目经理2211775
内政部： 10.1084/jem.20040139

体外扩增抗原特异性调节性T细胞抑制自身免疫性糖尿病

七枝汤等。实验医学杂志. 2004.

.2004年6月7日；199(11):1455-65.

doi:10.1084/jem.20040139。

作者

七枝汤¹, 卡米·亨利克森, 毕明英, 埃里克·B·芬格, 格雷格·绍特, 叶建勤, 艾玛·L·马斯特勒, 休·麦克德维特, 马克·邦哈迪, 杰弗里A Bluestone

附属

¹加州大学旧金山分校UCSF糖尿病中心，94143，美国。

PMID： 15184499
预防性维修识别码：项目经理2211775
内政部： 10.1084/jem.20040139

摘要

CD4+CD25+调节性T细胞（Tregs）的低数量、它们的无能表型和不同的抗原特异性为利用这种强大的耐受性群体治疗自身免疫和移植排斥反应带来了重大挑战。在这项研究中，我们描述了一种从自身免疫的非肥胖糖尿病小鼠中扩增抗原特异性Tregs的稳健方法。使用抗CD3、抗CD28和白细胞介素2的组合，纯化的CD4+CD25+Tregs在体外不到2周的时间内扩增到200倍。扩增的Tregs在体内外均表达经典的细胞表面表型和功能，以抑制效应T细胞功能。最重要的是，少量抗原特异性Tregs可以在疾病发作后逆转糖尿病，这表明了一种新的细胞免疫治疗自身免疫的方法。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
T的体外扩增_法规（A）NOD（左）、BDC2.5（中）和GAD286（右）小鼠CD4细胞上CD25和CD62L表达的代表性流式细胞术图。FACS公司^®-纯化T_法规（•）和CD4⁺cd62升⁺CD25型⁻用抗CD3和抗CD28包被珠以及IL-2体外刺激来自NOD（B）、BDC2.5 TCR Tg（C）或GAD286 TCR Tg（D）小鼠的细胞（○）。（E） BDC2.5 TCR Tg小鼠的T细胞如上所述用p31连锁IA扩增^第7组-将mIgG2a固定在乳胶珠上。所有培养物均通过活细胞计数进行定量。

**图2。**
体外扩增T细胞表型_法规（A）CD25和CD62L在扩张T细胞上的表达_法规和CD4⁺cd62升⁺CD25细胞⁻培养开始后第8天用流式细胞仪检测细胞。结果代表了20多个独立实验。（B）在培养开始后的第10天，通过实时PCR分析测定扩增NOD（填充符号）或BDC2.5 TCR Tg T细胞（开放符号）中指示基因的mRNA水平。相对表达率（T_注册/T型_CD25型 ⁻)根据材料和方法中所述的Ct值计算每对培养物的Ct。虚线表示1的比率（即T中相同水平的基因表达_注册和CD4⁺cd62升⁺CD25型⁻文化）。（C）新鲜和扩增T细胞中FoxP3蛋白表达的Western blot分析。微管蛋白表达水平作为负荷对照。结果代表了三个独立的实验。（D）用抗原肽和脾APC重新刺激48小时后，扩张的BDC2.5 T细胞分泌细胞因子。结果代表了两个独立的实验。

**图3。**
扩张T细胞体外抑制_法规.（A）新鲜和膨化T_法规比较了它们抑制CD4增殖的能力⁺用抗CD3和T细胞缺失的脾细胞刺激应答者T细胞。（B） T抑制_法规如A所述，对BDC2.5 TCR Tg或GAD286 TCR Tg小鼠进行扩增。（C）BALB/C-扩增T的抑制活性_法规CD4上⁺用抗CD3或OVA肽刺激DO11.10 TCR Tg小鼠的应答T细胞。结果代表了三个独立的实验。

**图4。**
扩张T细胞的体内存活和激活_法规（A）新鲜分离和扩增的BALB/c T_法规用CFSE标记，然后注射到正常BALB/c小鼠（10⁶/鼠标）。所有受体小鼠在注射后第30天被处死，CFSE数量⁺流式细胞术检测外周淋巴结和脾脏（未显示）中的细胞。数据以CD4的数量表示⁺CFSE公司⁺单元格/10⁶内源性CD4⁺T细胞。每个圆圈表示一个鼠标的值，黑色条表示组的平均值。（B）扩展T_法规来自NOD。用CFSE和3×10标记Thy1.2（顶部）和GAD286 TCR Tg Thy1.2⁶被转移到正常的8-12周龄NOD。您的1.1收件人。扩增BDC2.5 TCR Tg Thy1.1用CFSE和3×10标记⁶被转移到正常的8-12周龄NOD。您的1.2收件人。在细胞转移后第7天，通过流式细胞术测定脾、淋巴结和胰腺淋巴结中转移细胞的存在及其激活状态。所示的点图在Thy1.2上为NOD和GAD286电池选通，在Thy1.1上为BDC2.5电池选通。图中显示了CFSE稀释细胞的百分比。在两个单独的实验中，结果代表了至少三只受体小鼠。

**图5。**
扩张T细胞预防糖尿病转移_法规.（A）激活的糖尿病原性BDC2.5 CD4⁺cd62升⁺CD25型⁻电池（3.5×10⁵)与BDC2.5扩张T共转染_法规至8周龄NOD。RAG公司^−/−收件人按指定比例。对单个受体小鼠的血糖进行监测，并绘制出糖尿病发病图。n个=3（对于无T）_法规1:9组；n个=1:1和1:3组为4。结果代表了三个独立的实验。（B）在6周龄的NOD中诱导糖尿病。RAG公司^−/−小鼠，以与A中所述相同的方式，除了转移的扩增T的数量_法规来自GAD286 TCR Tg小鼠和BDC2.5 TCR Tg小鼠的转移T的数量等于_效率(n个=3只小鼠/组）。（C）糖尿病是在5-8周龄的NOD中诱发的。RAG公司^−/−或NOD。TCR-α^−/−25×10注射受体⁶糖尿病供体脾和LN细胞的混合(n个= 8). 一些受体小鼠被注射扩张T细胞_法规来自NOD（2×10⁶,n个= 3; 5 × 10⁶,n个= 3; 8 × 10⁶,n个=4）或BDC2.5 TCR Tg小鼠（2×10⁶,n个= 4). 结果代表两个独立的实验。

**图6。**
NOD中自身免疫性糖尿病的预防。CD28编号^−/−BDC2.5-expanded T小鼠_法规.5周龄糖尿病前期NOD。CD28编号^−/−小鼠注射5×10⁵BDC2.5膨胀T_法规(n个=3）或未经处理(n个=4）。监测糖尿病的发展，绘制单个小鼠的血糖水平。结果代表了至少五个独立实验。

**图7。**
扩张T型糖尿病的逆转_法规（A）将患有慢性糖尿病的NOD小鼠移植到肾包膜下的同种异体胰岛。移植当天，一些受体小鼠接受5×10⁶NOD-膨胀T_法规(n个=4）或2×10⁶BDC2.5-膨胀T_法规(n个=5），其余小鼠(n个=3）未经治疗。监测血糖水平。所有胰岛受体在移植后第一天内血糖恢复正常。结果代表了两个独立的实验。（B）患有新发糖尿病的NOD小鼠（血糖>300 mg/dL，n个=7）注射10⁷BDC2.5-膨胀T_法规并监测血糖。连续两次血糖读数<250 mg/dL被视为糖尿病缓解。

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1. Shull，M.M.、I.Ormsby、A.B.Kier、S.Pawlowski、R.J.Diebold、M.Yin、R.Allen、C.Sidman、G.Proetzel、D.Calvin等人，1992年。靶向性破坏小鼠转化生长因子-beta 1基因会导致多灶性炎症疾病。自然。第359:693–699页。-项目管理咨询公司-公共医学
1. Hori、S.、T.Nomura和S.Sakaguchi。2003.转录因子Foxp3对调节性T细胞发育的控制。科学。299:1057–1061.-公共医学

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