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。2004年9月1日；382（第2部分）：527-33。
doi:10.1042/BJ20031819。

神经酰胺代谢的亚细胞分区：MAM（线粒体相关膜）和/或线粒体？

克拉拉·比昂达 1, 雅克·波图卡利安, 丹尼尔·施密特, 克莱尔·罗德里格斯-拉夫拉斯, 多米尼克·阿达尔
附属公司

神经酰胺代谢的亚细胞区室化：MAM（线粒体相关膜）和/或线粒体？

克拉拉·比昂达等。 生物化学杂志。 。

摘要

我们小组和其他人最近的研究揭示了线粒体中存在神经酰胺，也报道了线粒体中神经酰胺合成酶和反向神经酰胺酶的活性。由于在以前的研究中不能排除ER（内质网）相关隔室MAM（线粒体相关膜）的可能污染，我们重新研究了线粒体和大鼠肝脏高纯度MAM中神经酰胺代谢酶的存在。在本文中，我们证明纯化的线粒体和MAM确实能够通过神经酰胺合成酶或反向神经酰胺酶在体外生成神经酰胺，而后者的酶活性在微粒体中几乎检测不到。此外，神经酰胺合成酶活性在线粒体外膜和线粒体内膜中都得到了恢复。用放射性标记的鞘氨醇作为底物，线粒体可以产生神经酰胺和植物神经酰胺。然而，线粒体和MAM中神经酰胺合成酶对FB1（伏马菌素B1）的体外敏感性取决于鞘氨醇碱：虽然二氢鞘氨醇N-酰基转移酶被FB1以浓度依赖性的方式抑制，但当使用鞘氨醇作为底物时，FB1实际上激活了神经酰胺合酶。1磷酸鞘氨醇和1磷酸二氢鞘氨醇发生酰化反应，生成1磷酸神经酰胺，这两种亚细胞组分也显示出来。此外，在两个磷酸化的鞘氨醇碱之间，神经酰胺合成酶活性对FB1的敏感性也存在相同的差异，这增加了不同的碱特异性酶可能作为神经酰胺合酶参与的可能性。总之，这些结果表明线粒体通过不同的途径参与神经酰胺的代谢，从而支持神经酰胺形成的拓扑结构可以决定其功能的假设。

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数字

图1
图1。纯化线粒体和MAM合成神经酰胺在体外
纯化的线粒体和MAM与[三H] 在实验部分描述的条件下，鞘氨醇和未标记的棕榈酰辅酶A。固相LC-NH纯化总脂提取物后2柱上，在氯仿/甲醇（12.5:1，v/v）溶剂体系中，在硅胶TLC上分析与神经酰胺相对应的组分（根据[28]，组分2）以及标准品。(A类)在磷酸（8%）中喷涂乙酸铜（3%）后，在150°C下观察标准品。巷1，神经酰胺类III；车道2，植物神经酰胺。(B类)从LC-NH洗脱的组分2的放射自显影2柱。通道1，线粒体；车道2，MAM。箭头表示图2中刮掉并重新运行的斑点。
图2
图2。通过神经酰胺合成酶活性获得的放射性标记产物的TLC
上面板：将图1中共存的斑点分别作为标准神经酰胺III型和植物神经酰胺从板上刮下，并在氯仿/甲醇（12.5:1，v/v）中的HPTLC板上重新运行。然后将板切成0.5厘米的部分，用氯仿/甲醇（2∶1，v/v）萃取，并在有机溶剂蒸发后计数放射性。十、 植物神经酰胺；Y、 神经酰胺。下板：从板上刮下上板上的放射性斑点，用氯仿/甲醇（2:1，v/v）萃取，并在预先涂有1%偏亚砷酸钠的硅胶板上用氯仿-甲醇（19:1，v/v）重新运行。将平板刮成0.5 cm的部分，用氯仿/甲醇（2:1，v/v）萃取，并在有机溶剂蒸发后计算放射性。十、 植物神经酰胺；Y、 神经酰胺。
图3
图3。放射性物质转化的时间过程[三H] 鞘氨醇转化为神经酰胺
培养条件如实验部分所述，但时间有所不同。放射性神经酰胺如图1所示进行纯化，并在刮取和液相粉碎计数之前在TLC上分离。插入，增加蛋白质浓度用于5分钟培养。结果为平均值±S。三个不同的实验。
图4
图4。FB的影响1线粒体神经酰胺合成酶的研究在体外
提纯的线粒体在37°C和20μM FB存在下预培养10分钟1，然后按照实验部分所述进行神经酰胺合成酶分析[三H] 鞘氨醇或[三H] 二氢鞘氨醇作为底物。培养15分钟后，在LC-NH上分离总脂质2柱，并通过硅胶TLC和放射自显影术进行分析。刮除与真实标准共存的放射性神经酰胺，并通过液相滴定计数估算放射性。结果为平均值±S。四个不同的实验。(A类)二氢鞘氨醇N-酰基转移酶。(B类)鞘氨醇N-酰基转移酶。
图5
图5。神经酰胺合成酶在MAM和线粒体下区室中的底物特异性在体外
将纯化的亚细胞组分（100μg蛋白质）与10μM鞘氨醇或植物鞘氨醇和2 nmol[14C] 棕榈酰辅酶A。固相LC-NH纯化总脂提取物后2将对应于神经酰胺的色谱柱、组分进行温和碱性水解，并通过硅胶TLC和放射自显影术进行分析。从板上刮下与真正的神经酰胺共存的放射性成分，并通过液相滴定计数估算放射性。结果为平均值±S。三个不同的实验。(A类)MAM公司。(B类)纯化线粒体(C类)提纯线粒体外层膜。(D类)纯化的线粒体内膜。
图6
图6。线粒体（A）和MAM（B）中外源磷酸化鞘氨醇碱的酰化比较
亚细胞组分（100μg蛋白质）在37°C下在10μM 1-磷酸鞘氨醇或1-磷酸二氢鞘氨醇和2 nmol[14C] 棕榈酰辅酶A（含或不含20μM FB1). 将放射性脂质进行温和碱性水解，并在LC-NH上进一步纯化2柱。将神经酰胺（在分数2中洗脱）和神经酰胺1-磷酸盐或二氢神经酰胺1-磷酸（在分数6中洗脱）应用于TLC，并在氯仿/甲醇（12.5:1，v/v）中运行神经酰胺或氯仿/醇/乙醇（6.5:1.5/1，按体积计）中运行。放射自显影后，从平板上刮去与真实标准共存的放射性斑点，并通过液相滴定计数估算放射性。结果为平均值±S。三个不同的实验。Cer、神经酰胺。
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