Asymmetric distribution of the apical plasma membrane during neurogenic divisions of mammalian neuroepithelial cells

doi:10.1038/sj.emboj.7600223

.2004年6月2日；23(11):2314-24.

doi:10.1038/sj.emboj.7600223。 Epub 2004年5月13日。

哺乳动物神经上皮细胞神经原性分裂过程中顶端质膜的不对称分布

小岛洋一¹, 卡贾·罗珀, 沃尔夫·豪本萨克, 安妮·玛丽·马尔泽斯科, 丹尼斯·科尔贝尔, Wieland B Huttner公司

附属公司

PMID： 15141162
预防性维修识别码：项目经理419905
内政部： 10.1038/sj.emboj.7600223

哺乳动物神经上皮细胞神经原性分裂过程中顶端质膜的不对称分布

小岛洋一等。欧洲工商管理硕士J. 2004.

.2004年6月2日；23(11):2314-24.

doi:10.1038/sj.emboj.7600223。 Epub 2004年5月13日。

作者

小岛洋一¹, 卡贾·罗珀, 沃尔夫·豪本萨克, 安内·马里·马尔泽斯科, 丹尼斯·科贝尔, Wieland B Huttner公司

附属

¹Max-Planck-Institute of Molecular Cell Biology and Genetics，德国德累斯顿Pfotenhauerstrasse 108，01307。

PMID： 15141162
预防性维修识别码：项目经理419905
内政部： 10.1038/sj.emboj.7600223

摘要

哺乳动物中枢神经系统神经发生开始时，神经上皮细胞从对称的增殖分裂转变为不对称的神经发生分裂。与果蝇成神经细胞的不对称分裂类似，哺乳动物神经上皮细胞的这种转换被认为涉及相对于神经上皮顶部表面的分裂平面方向从垂直（垂直分裂）到平行（水平分裂）的变化。在这里，我们报告，使用TIS21-GFP敲除小鼠胚胎来鉴定神经原性神经上皮细胞，在神经发生的开始和晚期，绝大多数神经原性分裂，如增殖分裂，显示出垂直分裂面。然而，值得注意的是，神经上皮细胞的神经原性分裂，而非增殖细胞的神经源性分裂，涉及到顶端质膜的子细胞的不对称分布，其仅占整个神经上皮细胞质膜的极小部分（1-2%）。我们的结果支持了哺乳动物中枢神经系统神经上皮细胞不对称神经原性分裂的细胞生物学基础的新概念。

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数字

图1
钙粘蛋白“孔”是鉴定NE细胞顶膜的一种手段。(A类)在小鼠胚胎神经上皮的顶端侧有明显的前泌素-1和钙粘蛋白定位。E9.0小鼠前脑冰冻切片中普罗米宁-1的双重免疫标记(一,**c（c）**; 绿色）和钙粘蛋白(b条,**c（c）**; 红色）。注意，在所示的单个光学切片中，神经上皮顶端的prominin-1和cadherin染色没有重叠(**c（c）**)正如预期的那样，早泌素-1与顶膜微绒毛的特异性结合以及外侧质膜最顶端的钙粘蛋白浓度。条形图输入(**c（c）**)=10μm。(B类)检测连续光学切片中的钙粘蛋白“洞”。E10.5小鼠中脑神经上皮冰冻切片进行钙粘蛋白免疫染色(**a–d**)显示通过共焦显微镜获得的四个连续、相邻的1μm光学切片。钙粘蛋白“孔”所显示的顶膜由小白条表示。箭头表示单个细胞的钙粘蛋白孔仅在其中一个光学部分可见(**c（c）**). 条形图输入(d日)=10微米。(C类)钙粘蛋白孔含有顶端膜特异性蛋白prominin-1。E10.5有丝分裂小鼠NE细胞冰冻切片DNA的三重标记(一,d日; 蓝色；碘化丙啶染色），钙粘蛋白(b条,d日; 红色）和催乳素-1(**c（c）**,d日; 绿色）。白色条表示有丝分裂NE细胞的顶膜(**b–d段**). 注意，在所示的单个光学切片中，外侧质膜的钙粘蛋白染色和顶端膜的prominin-1染色是相互排斥的，钙粘蛋白孔被免疫染色为prominin-1(d日).

图2
NE细胞分裂过程中分裂面和顶膜均匀与不均匀分布的测定。(A类)测定解理面。用碘化丙啶对E9.5小鼠后脑神经上皮冰冻切片进行DNA染色。(**a–d**)有丝分裂NE细胞后期的四个连续、相邻的1μm光学切片。所示的细胞是一个典型的例子，在每个光学切片中，预期子细胞的姐妹染色单体在大小和形状上相似，表明单个光学切片的扫描平面垂直于解理平面，在这种情况下，可以准确推断出(**c（c）**))如面板所示**e（电子）**和**（f）**只有符合这一标准的有丝分裂NE细胞（大约每五个细胞被归类为晚期或末期）才被纳入随后的分析（见材料和方法）。(**e–h**)解理面的推导。面板中观察到的DNA染色**c（c）**和**文学士**如所示(**e（电子）**)和(克)（阴影区域），矩形设计适合这种染色(**（f）**和小时）。推导出矩形之间的相对方向（黑色长线延伸矩形的一侧）。在中所示的示例中(**（f）**)，矩形彼此平行，解理面位于两者之间的一半（红色虚线）。在中所示的示例中(小时)，矩形彼此以一定的角度定向，并且推断解理平面的位置使该角度减半（红色虚线）。(B类)两个相等的例子(**a–d**,**e–小时**)和不平等(**i–l**,**百万英镑**)根尖膜的分布。(**a–d**,**e–h**,**i–l**和**百万英镑**)在E11.5小鼠中脑的冰冻切片中，每个细胞都有一个三重标记的NE细胞。根据在连续光学切片中观察到的DAPI染色的姐妹染色单体的取向推断出解理面（白色虚线），其中一个如图所示(一,**e（电子）**,我,米和d日,小时,我,第页; 蓝色），如（A）所述。苯胺免疫染色证实了推断的切割面(**c（c）**,克,k个,o个和d日,小时,我,第页; 绿色）。通过对钙粘蛋白进行免疫标记，确定了顶端膜，即钙粘蛋白孔（白色条）(b条,**（f）**,j个,n个和d日,小时,我,第页; 红色）。在顶部两行显示的有丝分裂NE细胞中(**a–d**和**e–h**)，顶膜将在切割时被一分为二，并平均分布到子细胞。相反，在底部两行显示的有丝分裂NE细胞中(**i–l**和**百万英镑**)顶端膜将被分裂绕过，分布不均，即仅分布到一个子细胞。注意，在第二个图中显示的有丝分裂NE细胞中(**e–h**)和第四(**百万英镑**)行，苯胺免疫染色显示的卵裂沟已到达顶端(克)和横向(o个)质膜（白色箭头），而第一个图中所示的有丝分裂的NE细胞尚未出现这种情况(**a–d**)和第三个(**i–l**)行。中的星号(n个)表示与所示有丝分裂NE细胞相邻的另一个细胞的钙粘蛋白孔。

图3
心尖膜的均匀与不均匀分布不一定与NE细胞的垂直与非垂直分裂面有关。E9.5–10.0小鼠后脑神经上皮冰冻切片的钙粘蛋白双标记(**A–C**; 红色）和DNA（A–C；蓝色；碘化丙啶染色）。在所示的单个光学截面中，白色条表示顶端膜（钙粘蛋白孔），白色虚线表示如图2A所示推导出的解理面。注意，在（B）中，劈理面垂直，但顶膜分布不均匀，而在（C）中，分裂面倾斜，但顶薄膜分布均匀。（B）中的星号表示所示有丝分裂NE细胞附近另一细胞的钙粘蛋白孔。

图4
杂合E11.5胚胎中脑顶膜的均匀与不均匀分布以及NE细胞的增殖与神经原性分裂*TIS21型*-GFP敲除小鼠。(A类)增殖分裂中顶端膜均匀分布的一个例子(**a–d）**神经源性分裂中顶膜分布不均的一个例子(**e–h）**. (**a–d**)和(**e–h**)每个细胞都有一个三重标记的有丝分裂NE细胞，由黄色圆点勾勒出来。根据连续光学切片中观察到的DAPI染色的姐妹染色单体的取向推断出了解理面（白色虚线），其中一个染色单体如图所示（DNA；一,**e（电子）**和d日,小时; 蓝色），如图2A所示。注意，两个实例中的解理面都是垂直的。通过对钙粘蛋白进行免疫标记，确定了顶端膜，即钙粘蛋白孔（白色条）(b条,**（f）**和d日,小时; 红色）。在第一排有丝分裂的NE细胞中(**a–d**)，顶端膜将被分裂一分为二，并均匀分布到子细胞，而在有丝分裂的NE细胞中位于最底层(**e–h**)顶端膜将被分裂绕过，分布不均，即仅分布到一个子细胞。NE细胞顶端膜分布均匀(**a–d**)不表达*TIS21型*-GFP（GFP−）(**c（c）**,d日; 绿色），表示增殖分裂，而NE细胞显示不均匀分布(**e–h**)做（GFP+）(克,小时; 绿色），表示神经源性分裂。注意在有丝分裂GFP阴性NE细胞附近的GFP表达细胞(**c（c）**)（星号）。(B类)增殖的NE细胞与神经原性NE细胞共存，其顶端膜分布均匀，分布不均。如图A所示，对两个有丝分裂的NE细胞进行分析。左侧有丝分裂NE细胞的顶端膜分布不均，即仅分布到一个子细胞，并且表达*TIS21型*-GFP（GFP+），表示神经原性分裂，而右侧有丝分裂NE细胞将其顶膜均匀分布到子细胞，不表达GFP（GFP-），表示增殖分裂。注意，对于右侧有丝分裂的NE细胞，所示光学切片中的钙粘蛋白孔小于下一个光学切片（未显示）中的钙粘蛋白孔。

图5
NE细胞不对称分裂产生的神经元不继承顶膜和prominin-1。(A类)E11.5后脑冰冻切片(**a–e）**和E11.5端脑(**g–k）**杂合的*TIS21型*-GFP敲除胚胎显示几乎完成胞质分裂的四标记分裂NE细胞。显示了单个光学截面；DNA，DAPI染色细胞核(一,**e（电子）**蓝色，克,k个蓝色）。在最上面一行的NE单元中(**a–e**)，它不表示*组织21*-GFP（GFP−）(**c（c）**,**e（电子）**绿色），因此进行增殖分裂，分裂沟即将平分顶端膜（即钙粘蛋白孔，白色条），如钙粘蛋白免疫染色所示(b条,**e（电子）**白色）和苯胺(d日,**e（电子）**红色）（在胞质分裂的这个阶段表示中体（Oegema等，2000）），导致其分布到两个子细胞(*平等的*). 相反，在最下面一行的NE单元格中(**克–克**)，它确实表示*TIS21型*-GFP（GFP+）(我,k个钙粘蛋白免疫染色显示，卵裂沟将绕过顶端膜（即钙粘蛋白孔，白色条），从而经历神经原性分裂(小时,k个白色）和苯胺(j个,k个红色），导致其仅分布到一个子细胞(*不相等的*). (**（f）**和我)漫画总结了细胞中通过质膜融合即将完成胞质分裂，如(**e（电子）**)和(k个)分别为；黑线、侧沟和分裂沟质膜；浅蓝色盒，顶膜；红色，苯胺；箭头，劈开的地方。(B类)E10.5杂合子端脑冷冻切片*TIS21型*-GFP敲除胚胎显示一个四重标记的新生神经元，该神经元通过βIII-管蛋白（βIII-tub，d日,**e（电子）**红色）并显示GFP荧光(**c（c）**,**e（电子）**绿色），表示其来源于*TIS21型*-表达GFP的NE细胞（Haubensak等, 2004). 显示了单个光学部分；DNA，DAPI染色细胞核(一,**e（电子）**蓝色）。请注意，阳性蛋白-1（prom-1，b条,**e（电子）**白色）。(C类)新生神经元（星号）的四个连续光学切片，通过对杂合子E11.5后脑冰冻切片中的βIII-管蛋白（红色）进行免疫染色鉴定*TIS21型*-GFP敲除胚胎。注意神经元向基底方向延伸，但不向神经上皮顶部延伸（顶部）。蓝色，DAPI染色的细胞核。

图6
NE细胞在不同发育阶段和不同杂合子胚胎脑区的顶膜分布均匀与不均匀，增殖与神经原性分裂*TIS21型*-GFP敲除小鼠。根尖膜的分布和表达*TIS21型*-如图4所示，分析有丝分裂NE细胞中GFP的发育阶段和大脑区域。对于一个特定的发育阶段和大脑区域，有丝分裂的NE细胞被分为四组：（i）顶端膜均匀分布（等距，纵坐标）和*TIS21型*-GFP-阴性（GFP-，横坐标）（灰色，平原），（ii）均匀分布和*TIS21型*-GFP阳性（GFP+，横坐标）（绿色，平面），（iii）顶膜分布不均（不相等，纵坐标）和*TIS21型*-GFP-阴性（灰色，阴影）和（iv）不均匀分布和*组织21*-GFP-阳性（绿色，阴影）。每组中的细胞表示为总数的百分比（四组之和），百分比值由各自正方形的面积和其中的数字表示。细胞数量为：E9.5前脑，n个=11; E11.5前脑，n个=18; E14.5前脑，n个=15; E10.5中脑，n个=10; E11.5中脑，n个=44（数据与表II相同，仅供参考）；和E11.5后脑，n个=11.

图7
猪杂合子胚胎中NE细胞增殖分裂与神经原性分裂与顶膜等量分布与不等量分布的相关性*TIS21型*-GFP敲除小鼠。根尖膜的分布和表达*TIS21型*-如图4所示，对有丝分裂NE细胞中的GFP进行了分析。对于这两种细胞，有丝分裂的NE细胞的顶膜分布均匀（左柱，n个=76）和不均匀分布（右栏，n个=39），百分比*TIS21型*-GFP阴性（灰色列）与*TIS21型*-计算GFP阳性（绿柱）细胞。汇集了不同发育阶段（E9.5–14.5）和大脑区域（前脑、中脑、后脑）的数据，因为主要观察结果是，大多数有丝分裂的NE细胞顶端膜分布均匀*TIS21型*-GFP阴性，即增殖，大多数细胞呈不均匀分布*TIS21型*-GFP阳性，即神经原性，与所分析的发育阶段和大脑区域无关（有关详细信息，请参见图6）。

图8
杂合子E10.5–E12.5胚胎后脑NE细胞增殖分裂与神经原分裂时par-3的分布相等与不相等*组织21*-GFP敲除小鼠。(A类)冰冻切片双重免疫荧光显示par-3的定位(b条,**c（c）**红色，**e（电子）**,**（f）**红色）与钙粘蛋白比较(一,**c（c）**绿色）和prominin-1(d日,**（f）**绿色）在E10.5的顶端侧(**d–f日**)和E12.5(**a–c**)后脑神经上皮。请注意，在所示的单个光学切片中，par-3的染色似乎比钙粘蛋白的最顶端染色更接近顶端，几乎没有重叠(**a–c**)，也在很大程度上不同于促氨酸-1的染色，后者似乎比par-3的染色更顶端(**d–f日**). 条形图英寸(**c（c）**)和(**（f）**)=10微米。(B类)增殖分裂中par-3的均匀分布示例(**a–e）**par-3在神经原性分裂中分布不均的一个例子(**f–j**). (**a–e**)和(**f–j**)在冰冻切片中，每个细胞都有一个四重标记的有丝分裂NE细胞。根据DAPI染色的姐妹染色单体（DNA、，一,**e（电子）**蓝色，**（f）**,j个蓝色）和钙粘蛋白的免疫标记(b条,**e（电子）**白色，克,j个白色），如图2和图4所示。单张光学切片显示，在有丝分裂的NE细胞的顶行(**a–e**)，心尖膜将被劈开和心尖部3一分为二(d日,**e（电子）**红色）分布到两个子细胞(*平等的*). 相反，在最下面一行有丝分裂的NE细胞中(**f–j**)，顶端膜将被卵裂和顶端par-3绕过(我,j个红色）仅分布到一个子单元(*不相等的*). 中的星号(j个)表示与所示有丝分裂NE细胞相邻的另一个细胞的顶端par-3。NE细胞显示顶端par-3的均匀分布(**a–e**)不表达*TIS21型*-GFP（GFP−）(**c（c）**,**e（电子）**绿色），表示增殖分裂，而NE细胞显示不均匀分布(**f–j**)是否（GFP+）(小时,j个绿色），表示神经源性分裂。

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