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.2004年6月；78(11):6043-7.
doi:10.1128/JVI.78.11.6043-6047.2004。

表达呼吸道合胞病毒（RSV）G糖蛋白的重组仙台病毒诱导对RSV的免疫保护

Toru Takimoto公司 1, 茱莉亚·L·赫尔维茨, 克里斯·科尔克劳夫, Cecilia Prouser公司, 萨提什·克里希纳穆尔西（Sateesh Krishnamurthy）, 詹晓燕, 凯利·博伊德, 露丝·A·斯克洛格斯, 布里塔·布朗, 永井佳彦, 阿伦·波特, 卡伦·S·斯洛博德
附属公司

表达呼吸道合胞病毒（RSV）G糖蛋白的重组仙台病毒诱导对RSV的免疫保护

Toru Takimoto公司等。 J维罗尔. 2004年6月.

摘要

虽然RSV会导致严重的儿童呼吸道疾病，但目前还没有有效的疫苗。为了获得活病毒疫苗的优势，我们使用鼠副流感病毒1型（仙台病毒[SV]）作为异种载体来传递RSV的G糖蛋白。之前已经显示过（J.L.Hurwitz，K.F.Soike，M.Y.Sangster，a.Portner，R.E.Sealy，D.H.Dawson，C.Coleclough，vaccine 15:533-540，1997）SV鼻内注射保护了非洲绿猴免受相关人类副流感病毒1型（hPIV1）的攻击，SV已作为hPIV1.疫苗进入临床试验（K.S.Slobod，J.L.Shenep，J.Lujan-Zilbermann，K.Allison，B.Brown，R.a.Scroggs，a.Portner，C.Coleclough，J.L Hurwitz，vaccine，出版）。利用反向遗传学方法制备了表达RSV G糖蛋白的重组SV，经大鼠鼻腔接种可诱导RSV特异性抗体并对RSV攻击产生保护作用。因此，RSV G-重组SV是一种有希望的RSV活病毒疫苗候选株。

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数字

图1。
图1。
pSV（+）RSVG的设计和RSVG靶基因的表达。（A） 在HN基因的非编码区创建一个独特的NotI限制性内切酶位点，以插入RSV G糖蛋白基因。使用QuikChange site-Directed Mutagenesis kit（加利福尼亚州拉霍亚市斯特拉赫内）将NotI位点引入pTF1（21）中pSeV（+）的亚克隆ClaI-EcoRI片段。然后用该修饰片段替换pSeV（+）中的野生型片段以产生pSV（+）N。通过使用包含NotI位点的正向引物和包含SV转录终止信号和另一转录起始信号（由基因间连接序列[CTT]分离）的反向引物克隆RSV G基因，其次是NotI站点。因此，RSV G转录起始于上游SV HN转录起始序列，并使用新的终止序列终止。利用新引入的转录起始序列启动SV HN转录。T7、T7启动子；核糖，丙型肝炎病毒核酶序列。黑色和灰色方框分别表示核蛋白（NP）、聚合酶（P）、基质（M）、融合（F）、血凝素-神经氨酸酶（HN）和大蛋白（L）的转录起始和终止序列。（B） HEp-2细胞裂解物的Western blot检测（约106细胞）感染rSV RSVG（左车道）或野生型rSV（右车道）。用0.2 ml TNE缓冲液（10 mM Tris[PH7.4]、150 mM NaCl、0.5%NP-40和1 mM EDTA）溶解细胞，并澄清（15000×克，10分钟）。上清液在非还原条件下进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移到Immobilon膜（Millipore，Danvers，Mass.），并用RSV G特异性单克隆抗体（克隆63-10F；Chemicon International Inc.，Temecula，Califor.）进行开发。全糖基化RSV G蛋白（N-和O-连接糖基化）在约90 kDa（G）下运行。中间带可能代表部分糖基化G蛋白，而下部带代表未糖基化的G蛋白。
图2。
图2。
rSV RSVG颗粒不含G蛋白。首先通过蔗糖梯度离心从感染细胞上清液（HEp-2细胞；MOI 5；34°C下72 h）中纯化rSV RSVG病毒颗粒，然后通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行分离。RSV感染的HEp2细胞裂解物（对照）也在SDS-PAGE上运行。（左）将凝胶转移到硝化纤维板上，并与针对RSV G蛋白的单克隆抗体反应。显示了每条通道中的裂解液流量。RSV G检测分析（SuperSignal West Pico化学发光试剂盒；Pierce Biotechnology，Rockland，Ill.）的灵敏度为1 pg。与从所有对照制剂（RSV感染细胞裂解液）中检测到的RSV G蛋白相比，即使使用12μG病毒蛋白，也无法从纯化的RSV RSVG中检测到RSV G蛋白质。（右）SDS-PAGE凝胶也用GelCode蓝色染色试剂（Pierce Biotechnology）染色，以鉴定纯化的rSV RSVG颗粒中存在的所有蛋白质。箭头表示RSV G蛋白在凝胶中的位置。SV蛋白质缩写与图1图例中描述的缩写相同。
图3。
图3。
rSV RSVG引物棉鼠产生rSV特异性抗体。（A） 用酶联免疫吸附试验检测免疫大鼠（灰条）和接受PBS（黑条）的对照大鼠的系列血清稀释液。RSV G转染293T细胞作为抗原来源。将生长在聚赖氨酸涂层24孔板中的293T细胞转染pCAGGS（0.5μg；在LipofectAMINE中）24 h。转染后，清洗孔，并在室温（RT）下与棉鼠试验血清（在PBS-0.1%牛血清白蛋白[BSA]中）系列稀释液反应30 min，再次清洗，然后在RT处与兔抗棉大鼠IgG（1:3000，PBS-0.1%BSA；Virion Systems，Rockville，Md.）反应30分钟。在RT处清洗微孔，并与抗兔免疫球蛋白G-辣根过氧化物酶结合物（1:3000 in PBS-0.1%BSA）孵育30分钟。再次清洗微孔，并与2,2′-叠氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）底物反应，并用分光光度计进行测量。结果报告为每次血清稀释时405 nm（外径405 nm）处的绝对光密度。（B） 通过斑块试验检测RSV中和活性。血清样本与RSV混合（100至500 PFU/孔；RT时1小时），将病毒-血清混合物接种到6孔板上的HEp-2细胞单层（80至90%融合液），培养1小时（37°C，5%CO2)然后覆盖含有甲基纤维素的培养基。培养板7天（37°C，5%CO2)去除甲基纤维素后，固定细胞（福尔马林磷酸盐），并对平板进行染色（苏木精和伊红），以进行斑块计数。结果以斑块减少百分比报告(年axis）在每次血清稀释时观察(x轴）。（C） 为了测量对RSV攻击的保护，用鼻内RSV（106PFU）启动后约4周。三天后处死动物，采集肺部，将肺组织切成大块碎片，与PBS（1 ml）混合，并在冰上用机械Dounce均质器（PowerGen125 PCR组织均质试剂盒；Fisher Scientific）处理。然后离心匀浆，收集上清液并冷冻保存以进行病毒定量（上清液体积在4.0至6.5 ml/只大鼠之间）。肺上清液中的RSV负荷通过上清液系列稀释液的斑块试验（见上文）测定。通过估计每个接种体积的菌斑数来确定病毒滴度，并基于获得的上清液的总体积来计算每只大鼠的总病毒负荷（沿年轴）。
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