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。2004年4月26日；32(8):2298-305.
doi:10.1093/nar/gkh560。 2004年印刷。

α1诱导的DNA弯曲是Mcm1-Alpha1复合物转录激活所必需的

爱德华·A·卡尔 1, 珍妮特·米德, 安德鲁·克弗森
附属公司

α1诱导的DNA弯曲是Mcm1-Alpha1复合物转录激活所必需的

爱德华·A·卡尔等。 核酸研究。 。

摘要

酵母Mcm1蛋白是MADS-box转录因子家族的创始成员，该家族通过与不同辅因子蛋白的相互作用参与调节不同的基因集。Mcm1与Matalpha1蛋白相互作用，激活α-细胞类型特异性基因的表达。为了了解辅因子α1对Mcm1-alpha1依赖性转录激活的需求，我们分析了体内Mcm1对α特异基因启动子的招募，发现在没有α1的情况下，Mcm1能够与α特异基因的启动子结合。这表明alpha1的功能比简单地招募Mcm1更复杂。包括Mcm1在内的多个MADS-box转录因子诱导DNA弯曲，有证据表明转录激活可能需要适当的弯曲。我们分析了在存在和不存在α1的情况下Mcm1-α1结合位点的Mcm1依赖性弯曲，发现与其他Mcm1结合位点相比，单独的Mcm1在该位点显示出减少的DNA弯曲。然而，α1的加入显著增加了DNA-bend，我们提供证据表明，该bend是完全转录激活所必需的。这些结果支持这样一个模型，即转录激活需要Mcm1-alpha1复合物适当弯曲DNA。

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数字

图1
图1
共识P元素与STE3型P'Q公司。这个STE3型除简并侧碱基5–8（粗体）外，P'Q与共有P-元素表现出很强的守恒性，其两侧为Q位点，即α1的结合位点。根据Mcm1的晶体结构，显示了Mcm1预测的DNA与位点外部区域的接触（13）。碱性触点用实线表示，磷酸盐触点用虚线表示。星号表示Mcm1结合位点的对称轴。位置–7和7对于共识P元素（16）的DNA弯曲非常重要。
图2
图2
Mcm1在缺乏α1的情况下结合P'Q元素体内使用含有未标记Mcm1（1、2、5和6道）或V5-epitope标记Mcm2（3、4、7和8道）的裂解液，使用抗V5抗体进行染色质免疫沉淀。A类材料一用空载体（pRS415，1-4通道）或野生型α1（pEC43，5-8通道）转化菌株。面板显示了所示启动子区域PCR扩增的溴化乙锭染色凝胶。使用α特异基因引物的PCR产物STE3型,SAG1公司和MF公司α1显示。的启动子片段一-特定的STE6标准Mcm1结合的基因作为阳性对照。YDL223C型，一个不受Mcm1调控的基因，用作阴性对照。通道1、4、5和8显示使用TC作为模板的PCR产物，而通道2、3、6和7使用免疫沉淀产物（IP）。
图3
图3
α1–Mcm1复合物比单独的Mcm1诱导DNA发生更大的弯曲。利用P-PAL（通道1-8）或STE3型-P'Q现场（车道9–24）如图所示。通道1-4、9-12和17-20显示与野生型Mcm1蛋白结合。5–8、13–16和21–24车道显示千立方厘米1-V34A突变体。车道1-16表示仅由Mcm1约束，而车道17-24表示存在α1约束。显示了每个绑定复合体的计算弯曲角度。
图4
图4
Mcm1–α1复合物增加了P'Q-T处的弯曲–7G站点。利用结合位点位置置换的EMSA，每个面板代表野生型Mcm1(A类)或千立方厘米1-突变体V34A(B类)，S37A(C类)，K40A(D类)，T66A(E类)和V34A/S37A(F类). 每个面板的1-4通道和9-12通道显示绑定到STE3型-P'Q现场。每个面板中的车道5-8和13-16显示与STE3型-带T的P'Q站点–7G替代。1-8号车道没有α1，9-16号车道有α1。将显示每个复杂体的计算弯曲角度。
图5
图5
影响Mcm1依赖性弯曲的突变不会改变与α1的相互作用。野生型和突变型Mcm1蛋白自身的DNA结合亲和力进行了标准化。将α1的连续稀释液（3倍）添加到每个Mcm1突变体中。相对于Mcm1野生型蛋白，α1与Mcm1–DNA复合物相互作用的倍数降低。
图6
图6
与α1相互作用的缺陷不会导致Mcm1–α1复合物中的弯曲缺陷。(A类)带有WT-Mcm1、T66E或S73R的EMSA绑定到P'Q站点（分别为车道2、6或10）或与α1复合（分别为通道3-5、7-9或11-13）。Mcm1蛋白浓度在每条车道上保持不变，连续稀释3倍α1。(B类)在没有α1（1–12车道）或存在α1（13–24车道）的情况下，使用Mcm1-WT（1–4、13–16车道）、T66E（5–8、17–20车道）和S73R（9–12、21–24车道。将显示每个复杂体的计算弯曲角度。
图7
图7
体内检测DNA弯曲对转录激活的影响。包含P'Q（实心棒）或P'Q-T的报告发起人–7G（开杆）用于驱动紫胶Z在WT或突变Mcm1背景中的表达。通过三次独立分析的平均值测定MATα细胞中报告者的激活，三次分析的差异小于10%。显示了与WT-P'Q位点的WT-Mcm1蛋白相关的激活百分比。
图8
图8
Mcm1残基T66有助于DNA弯曲和辅因子相互作用（18）。Mcm1二聚体的模型基于Mcm1–α2 DNA三元复合物的坐标（13）。右侧面板中突出显示了DNA弯曲所需的残基侧链V34、S37、K40和T66。左图中突出显示了侧链对与α1、T66和S73相互作用的重要性。
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