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.2004年5月；78(10):5258-69.
doi:10.128/jvi.78.10.5258-5269.2004。

甲型流感病毒神经氨酸酶跨膜结构域和胞质尾部氨基酸序列在筏结合和病毒出芽中的作用

Subrata酒吧 1, 洛帕·阿迪卡里, 阿洛克·查克拉巴蒂, 卡尔·伯纳斯, 川冈义弘, 德比·P·纳亚克
附属公司

甲型流感病毒神经氨酸酶跨膜结构域和胞质尾部氨基酸序列在筏结合和病毒出芽中的作用

Subrata酒吧等人。 J维罗尔. 2004年5月.

摘要

流感病毒神经氨酸酶（NA）是一种II型跨膜糖蛋白，具有受体去甲活性，从而促进病毒从细胞表面释放。在甲型流感病毒中，NA的细胞质尾部（CT）和跨膜结构域（TMD）氨基酸序列高度保守，但其在病毒生物学中的功能尚不清楚。为了研究CT和TMD的氨基酸序列在病毒生命周期中的作用，我们通过将2到5个相邻氨基酸转化为丙氨酸，对NA的整个CT和TMDs进行系统突变。此外，我们还通过用人转铁蛋白受体（TR）（一种II型跨膜糖蛋白）的氨基酸替换NA-TMD[NA（1T2N）NA]和整个NA-TMD（NATRNA）的CT近端三分之一氨基酸，制备了两个嵌合NA。我们通过反向遗传学拯救了转染突变病毒，并检测了它们的表型。我们的结果表明，所有突变和嵌合的NAs都可以被拯救到转染病毒中。不同突变体对病毒的生长和复制具有多效性。一些突变体（NA2A5、NA3A7和NA4A10）对病毒生长几乎没有影响，而其他突变体（NA3A2、NA5A27和NA5A31）产生大约50到100倍的无感染性病毒，还有一些突变体表现为中间表型（NA5A14、NA4A19和NA4A23）。总的来说，TMD胞外域-最大序列的突变会逐渐导致NA酶活性降低，影响脂筏结合，并减弱病毒生长。电子显微镜分析表明，这些突变病毒仍然聚集并结合在受感染的细胞表面，并且可以通过细菌NA处理从受感染的细胞中释放出来。此外，含有CT末端N端突变的病毒（NA3A2）以及含有TMD的嵌合NA用TR TMD部分或全部替换了[NA（1T2N）NA]或NATRNA，导致病毒生长减少，并表现出细长颗粒的形态表型。这些结果表明，尽管NA-CT和TMD序列本身对病毒的生命周期不是绝对必要的，但特定氨基酸序列在提供NA的结构稳定性、酶活性和脂筏结合方面起着关键作用，一些变异病毒的异常形态发生，包括细长颗粒的形成，表明NA参与了病毒的形态发生和出芽。

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数字

图1。
图1。
NA突变体的示意图。NA CT或TMD中2至5个氨基酸的集合被丙氨酸取代。嵌合NA TMD[NA（1T2N）NA和NATRNA]是通过将前9个氨基酸或整个NA TMD与TR TMD交换而构建的，NA序列中的氨基酸。粗体显示的氨基酸来自TR序列。小写形式的氨基酸是由限制性内切酶位点产生的。请注意，TR TMD包含28 aa，而非NA TMD的29 aa。上述氨基酸序列的数字表示WT NA肽的氨基酸位置（用↓表示）。
图2。
图2。
不同突变病毒的生长曲线。MDCK细胞单层以0.001的MOI感染病毒，并在VGM中保持在33°C，不含（A）或（B）0.5μg TPCK处理的胰蛋白酶/ml。在p.i.的不同时间点，收集培养上清液的等分样品，并通过PFU分析滴定感染病毒。▴, WT；⋄，NA3A2；□, NA2A5；Δ，NA3A7；×，NA4A10；©，NA5A14；○, NA4A19；♦, NA4A23；•，NA5A27；+，NA5A31；−，NA（1T2N）TR；▪、，NATRNA。结果表示四个独立实验结果的平均值。
图2。
图2。
不同突变病毒的生长曲线。用MOI为0.001的病毒感染MDCK细胞单层，并在不含（A）或含（B）0.5μg TPCK处理的胰蛋白酶/ml的VGM中保持在33°C。在不同的时间点，收集培养上清液的等分试样，并通过PFU测定滴定感染性病毒。▴, WT；⋄，NA3A2；□, NA2A5；Δ，NA3A7；×，NA4A10；Ж，编号5a14；○，NA4A19；♦, NA4A23；•，NA5A27；+，NA5A31；−，NA（1T2N）TR；▪、，NATRNA。结果表示四个独立实验结果的平均值。
图3。
图3。
不同突变病毒的菌斑形态。用连续稀释的病毒感染MDCK细胞单层（直径35mm的培养皿），并在含有（+）或不含（-）TPCK处理的胰蛋白酶（0.5μg/ml）的琼脂糖覆盖培养基中保持不同温度。在60小时p.i.时，取出琼脂糖覆盖培养基，用结晶紫染色1分钟，并用PBS洗涤。
图4。
图4。
突变病毒的唾液酸酶活性。用2′-（4-甲基伞形花序基）-α测定唾液酸酶活性-d日-N个-材料和方法中所述的乙酰神经氨酸底物。通过将NA活性归一化为病毒颗粒水平来计算比活性，这是通过免疫印迹病毒蛋白（用SDS-PAGE分离）和M1抗体测定的，然后进行密度分析。根据三个独立实验的结果计算出相对NA活性，WT病毒的相对NA活性为100%，平均变异小于10%。
图5：。
图5：。
细菌NA对病毒释放的影响。病毒感染的MDCK细胞被代谢标记为300μCi35S-蛋白标记混合物在2:8 VGM中放置9小时。采集前2小时，用细菌NA（10 mU/ml）处理（+）或模拟处理（-）病毒感染细胞。在14h p.i.时，收集上清液中释放的病毒颗粒，并通过低速离心进行澄清，通过25%蔗糖缓冲液进行超速离心纯化和造粒。将颗粒溶解在TNE缓冲液中。通过SDS-PAGE直接分析病毒蛋白，放射自显影并定量。用M1带测定NA处理后病毒释放量的增加。M1（+）/M1（−）的平均值是根据三到五个独立实验的结果计算出来的，变化小于10%。
图6。
图6。
病毒粒子中的NA蛋白掺入。用200μCi的352:8 VGM中的S蛋白标记混合物。在16h p.i.时，收集培养基并通过低速离心进行澄清，通过25%蔗糖缓冲液超速离心造粒病毒。标记的病毒粒子裂解物用相应的抗体进行免疫沉淀；洗脱蛋白质，用PNGase F处理3 h，用SDS-PAGE分析，并进行放射自显影。
图7。
图7。
Triton X-100细胞表面蛋白质的不溶性。在p.i.4 h时，感染流感病毒（VSV感染细胞为p.i.2.5 h）的MDCK细胞被代谢标记60 min，300μCi35S-蛋白标记混合物/ml并追踪90分钟。细胞表面蛋白生物素化，并用1%Triton X-100在冰上提取10分钟。Triton X-100-可溶性（S）和不溶性（I）表面生物素化蛋白部分用NA、HA或VSV G蛋白的特异抗体免疫沉淀，用SDS-PAGE分析，放射自显影，并进行量化。Triton X-100不溶性蛋白质的百分比是根据三到五个独立实验的结果计算得出的，平均变化小于10%。*，用HA0和HA1谱带计算了HA的Triton X-100不溶性。
图8。
图8。
Triton X-100病毒中不同蛋白质的不溶性。35如图6图例所述，制备S标记的病毒粒子，并用0.1%Triton X-100在冰上处理10分钟，用相应抗体免疫沉淀可溶性（S）和不溶性（I）组分，洗脱蛋白质，用PNGase F处理3小时，用SDS-PAGE分析，自射线照相和定量。Triton X-100不溶性蛋白质的百分比是根据三到五个独立实验的结果计算得出的，平均变化小于10%。
图9：。
图9：。
通过薄片电子显微镜观察病毒的萌芽。聚碳酸酯过滤器上生长的MDCK细胞感染了不同的病毒，MOI为3.0。在p.i.第12小时，感染细胞单层在2%戊二醛中交联并用1%OsO后固定4滤光片嵌入Epon中，用乙酸铀和柠檬酸铅对60 nm厚的切片进行染色，并用透射电子显微镜进行检查。棒材，1μm。→, 细长病毒颗粒；⇒, 绒毛。
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    1. Ali，A.、R.T.Avalos、E.Ponimaskin和D.P.Nayak。2000.流感病毒组装：流感病毒糖蛋白对M1蛋白膜结合的影响。J.维罗尔。74:8709-8719.-项目管理咨询公司-公共医学
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