跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2004年2月16日；164(4):493-9.
doi:10.1083/jcb.200309082。 Epub 2004年2月9日。

通过单个细胞器的光标记定量线粒体动力学表明，线粒体融合在凋亡的Bax激活期被阻断

马吕斯·卡博夫斯基 1, 达米安·阿诺特, Xiuchen Chen先生, 大卫·C·陈, 卡罗琳·史密斯, 理查德·尤尔
附属公司

通过单个细胞器的光标记定量线粒体动力学表明，线粒体融合在凋亡的Bax激活期被阻断

马吕斯·卡博夫斯基等人。 J细胞生物学. .

摘要

细胞器融合和分裂的动态平衡调节线粒体形态。在细胞凋亡过程中，这种平衡被改变，导致线粒体广泛断裂，我们描述了一种新的基于细胞共焦成像的线粒体动力学分析方法，该细胞表达线粒体基质靶向光激活绿色荧光蛋白，能够检测和量化活细胞中的细胞器融合。使用这种方法，我们可视化并定量了健康细胞和凋亡细胞中的线粒体融合率。在凋亡过程中，线粒体融合被阻断，与半胱氨酸蛋白酶的激活无关。线粒体融合中的阻滞发生在线粒体上Bax融合和线粒体外膜通透性的同一时间范围内，可能是凋亡过程中Bax/Bak活化的结果。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1。
mito-PAGFP的光激活和可视化。HeLa细胞（A）、原代心肌细胞（B）和原代海马神经元（C）与mito-DsRED2（显示线粒体在Adobe Photoshop中用浮雕过滤器处理）和mito-PAGFP（绿色）共同转染。为了对PAGFP进行光活化，用413-nm的光照射标有白色圆圈（pre）的区域，如材料和方法中所述。在413-nm光活化之前（前）和之后（后）约30 s，使用488-nm激光激发成像Mito-PAGFP。注意到在光活化区域附近有丝分裂PAGFP的荧光增加。
图2。
图2。
使用mito-PAGFP对线粒体融合进行可视化和量化。（A） 将原代海马神经元（A–c）和HeLa细胞（d–e）与mito-DsRED2（在Adobe Photoshop中用浮雕过滤器处理）和mito-PAGFP（绿色）共同转染。一些线粒体内的线粒体-PAGFP被413-nm的光激活，随后进行延时3D共焦显微镜观察。活化和非活化线粒体（箭头）显示在线粒体融合和线粒体内基质内容物交换之前（a–e）和之后（a‘–e’）30 s（通过非活化线粒体中活化的线粒体-PAGFP数量增加可见）。（B） 有丝分裂原PAGF转染HeLa细胞（预激活）中的红色圆圈所示区域被光激活，然后延时采集图像。在45到50秒之间，光激活的线粒体分裂（箭头），然后在180秒时，线粒体-PAGFP从激活的线粒体重新分布到非激活的线粒体（箭头，），表明线粒体融合。为了突出显示活化线粒体中的荧光减少和非活化细胞器中的荧光增加，图像采用了假彩色（右）。（C） HeLa（a）、Cos-7细胞（b）、海马神经元（C）、WT MEFs（d）和Mfn1−/−用mito-PAGFP转染MEF（e），然后对每个细胞进行一到四个ROI的光激活（白色圆圈），并按照材料和方法中的描述，对覆盖整个细胞厚度的一系列z截面进行延时共聚焦采集。所示图像是z系列的伪彩色投影。（D） HeLa（a）、Cos-7（b）、海马神经元（c）、WT MEF（D）和Mfn1的活化（红色）和非活化（黑色）线粒体内荧光强度的变化−/−MEF（e）随时间变化进行测量，如材料和方法中所述。注意Mfn1中活化的mito-PAGFP荧光强度的微小变化−/−当基质含量重新分布时，MEF即使在光激活后1小时也会大大降低其他细胞类型中mito-PAGFP的荧光强度。
图2。
图2。
使用mito-PAGFP对线粒体融合进行可视化和量化。（A） 将原代海马神经元（A–c）和HeLa细胞（d–e）与mito-DsRED2（在Adobe Photoshop中用浮雕过滤器处理）和mito-PAGFP（绿色）共同转染。一些线粒体内的线粒体-PAGFP被413-nm的光激活，随后进行延时3D共焦显微镜观察。活化和非活化线粒体（箭头）显示在线粒体融合和线粒体内基质内容物交换之前（a–e）和之后（a‘–e’）30 s（通过非活化线粒体中活化的线粒体-PAGFP数量增加可见）。（B） 有丝分裂原PAGF转染HeLa细胞（预激活）中的红色圆圈所示区域被光激活，然后延时采集图像。在45到50秒之间，光激活的线粒体分裂（箭头），然后在180秒时，线粒体-PAGFP从激活的线粒体重新分布到非激活的线粒体（箭头，），表明线粒体融合。为了突出显示活化线粒体中的荧光减少和非活化细胞器中的荧光增加，图像采用了假彩色（右）。（C） HeLa（a）、Cos-7细胞（b）、海马神经元（C）、WT MEFs（d）和Mfn1−/−用mito-PAGFP转染MEF（e），然后对每个细胞进行一到四个ROI的光激活（白色圆圈），并按照材料和方法中的描述，对覆盖整个细胞厚度的一系列z截面进行延时共聚焦采集。所示图像是z系列的伪彩色投影。（D） HeLa（a）、Cos-7（b）、海马神经元（c）、WT MEF（D）和Mfn1的活化（红色）和非活化（黑色）线粒体内荧光强度的变化−/−MEF（e）随时间变化进行测量，如材料和方法中所述。注意Mfn1中活化的mito-PAGFP荧光强度的微小变化−/−当基质含量重新分布时，MEF即使在光激活后1小时也会大大降低其他细胞类型中mito-PAGFP的荧光强度。
图3。
图3。
凋亡期间线粒体融合的抑制。对单独转染mito-PAGFP（A–C）的HeLa细胞或联合转染经75μM zVAD-fmk预处理并经稀释剂、DMSO（A）、ActD（B和D）或STS（C和E）处理的mito-PAGFP和CFP-Bax（D和E）的HeLa细胞进行线粒体融合分析。在1、60和120分钟的光激活后，每30分钟收集一次图像，超过180分钟收集一份图像。测量每个时间点的mito-PAGFP荧光强度，并绘制时间曲线。（F） 根据时间绘制了各实验组在1、60和120分钟后的mito-PAGFP荧光百分比下降值。数据表示每组32–52个单细胞延时测量值的平均±SD。
图3。
图3。
凋亡期间线粒体融合的抑制。对单独转染mito-PAGFP（A–C）的HeLa细胞或联合转染经75μM zVAD-fmk预处理并经稀释剂、DMSO（A）、ActD（B和D）或STS（C和E）处理的mito-PAGFP和CFP-Bax（D和E）的HeLa细胞进行线粒体融合分析。在1、60和120分钟的光激活后，每30分钟收集一次图像，超过180分钟收集一份图像。测量每个时间点的mito-PAGFP荧光强度，并绘制时间曲线。（F） 根据时间绘制了各实验组在1、60和120分钟后的mito-PAGFP荧光百分比下降值。数据表示每组32–52个单细胞延时测量值的平均±SD。
图4。
图4。
线粒体融合对Bax线粒体激活的抑制。（A） 用mito-PAGFP（假彩色）和CFP-Bax（红色）共同转染HeLa细胞，用75μM zVAD-fmk处理，在添加1μM STS后，随后对所选区域（a1、a2和a3）进行顺序光激活并获取序列图像。在所示的例子中，两次连续的光激活（b和f）之后是有丝分裂原PAGFP的有效融合和重新分布。添加STS（i）后76分钟，当线粒体Bax易位变得明显时，没有基质交换，表明线粒体融合受到抑制。插图显示细胞光激活区内的线粒体PAGFP和CFP-Bax荧光放大。（B） 在添加STS和连续光活化后，代表性细胞中有丝分裂原PAGFP平均荧光强度的变化，如A所示。（C）CFP-Bax的均匀性，反映了Bax在B所示细胞内的活化和聚集（见材料和方法），随时间测量并绘制曲线。B和C中的相同颜色和图案线来自相同的细胞。A中所示细胞的线粒体融合和Bax融合动力学由B和C中的绿线表示。注意每种情况下Bax移位时间和线粒体融合抑制的相关性。
图5。
图5。
MOMP和抑制线粒体融合。（A） 用mito-PAGFP（假彩色）、Smac/DIABLO-CFP（红色）和pCDNA-Bax共同转染HeLa细胞，并用75μM zVAD-fmk处理，在添加1μM STS后，随后对选定区域（a1、a2和a3）进行顺序光激活并获取序列图像。注意MOMP（i）和线粒体融合抑制的密切时间相关性。面板i–m中Smac/DIABLO-CFP图像的亮度增加，以更清晰地显示蛋白质的释放。插图显示细胞光激活区内的丝裂原-PAGFP荧光放大。（B） 在加入STS和如A所示的一系列光活化后，不同细胞中有丝分裂PAGFP的平均荧光强度的变化。（C）随着时间的推移，测量B所示细胞内Smac/DIABLO-CFP的均匀性的增加，反映线粒体的释放（见材料和方法），并绘制与时间的关系图。B和C中的相同颜色和图案线来自相同的细胞。A中所示的单元格由B和C中的绿线表示。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

参考文献

    1. Breckenridge，D.G.，M.Stojanovic，R.C.Marcellus和G.C.Shore。2003年。BAP31的半胱氨酸蛋白酶裂解产物通过内质网钙信号诱导线粒体分裂，增强细胞色素c向胞浆的释放。《细胞生物学杂志》。160:1115–1127.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Chen，H.、S.A.Detmer、A.J.Ewald、E.E.Griffin、S.E.Fraser和D.C.Chan。2003年。线粒体融合蛋白Mfn1和Mfn2协调调节线粒体融合，对胚胎发育至关重要。《细胞生物学杂志》。160:189–200.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Frank，S.、B.Gaume、E.S.Bergmann-Letiner、W.W.Leitner、E.G.Robert、F.Catez、C.L.Smith和R.J.Youle。2001。动力蛋白相关蛋白1，线粒体分裂的介质，在细胞凋亡中的作用。开发单元。1:515–525.-公共医学
    1. Hsu，Y.T.和R.J.Youle。1998年。小鼠胸腺中的Bax是一种可溶性单体蛋白，表现出不同的洗涤剂诱导构象。生物学杂志。化学。273:10777–10783.-公共医学
    1. Ishihara，N.、A.Jofuku、Y.Eura和K.Mihara。2003年，通过膜电位和哺乳动物细胞中DRP1依赖性分裂和FZO1依赖性融合反应调节线粒体形态。生物化学。生物物理学。Res.Commun公司。301:891–898.-公共医学

MeSH术语