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.2004年1月5日；164(1):69-78.
doi:10.1083/jcb.200303037。

疏水结构域在小窝蛋白-1靶向脂滴中的作用

安妮·奥斯特梅尔 1, 林恩·T·拉姆查兰, 曾友春, 道格拉斯·卢布林, 黛博拉·布朗
附属公司

疏水结构域在小窝蛋白-1靶向脂滴中的作用

安妮·奥斯特梅尔等。 J细胞生物学. .

摘要

尽管小窝蛋白通常位于小窝内，但它们可以积聚在细胞质脂滴（LD）的表面。在这里，我们首先为我们的模型提供了支持，即内质网（ER）中小窝蛋白的过度积累将蛋白质转移到从内质网出芽的新生LD。接下来，我们发现存在于ER细胞质表面但缺乏疏水性肽域的突变H-Ras没有在LD上积累。我们利用brefeldin A治疗后野生型caveolin-1在LD中积累的事实，或当与ER检索基序关联时，寻找LD靶向缺陷的突变体。疏水结构域，但其中没有特定序列，是小窝蛋白-1的LD靶向所必需的。某些Leu插入阻断LD靶向，与疏水结构域长度无关，但取决于它们在结构域中的位置。我们认为，LD靶向小窝蛋白-1可能需要适当的疏水螺旋包装。

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数字

图1。
图1。
药物对小窝蛋白-1 LD积累的影响。COS细胞未经处理（A–C）或仅用BFA（D–F）处理，或用BFA加诺卡唑（G–I）、细胞松弛素B（J–L）或环己酰亚胺（M–O）处理5小时。用IF加抗小窝蛋白-1和Alexa Fluor 350-GAR（左）检测小窝蛋白1，用尼罗红检测LDs（中）。右，合并的图像。使用100倍物镜拍摄图像。每个图像显示一个单元格的一部分；对于方向，F和I中右下角的暗区是原子核的边缘。棒，5μm。
图2。
图2。
H-Ras和跨膜蛋白PLAP-HA均未在LDs中积累。（A、B、D和E）GFP标记的非棕榈酰化H-Ras（A和B）和Cav-KKSL（D和E。未用BFA处理细胞（A和D；同一细胞）或处理细胞（B和E；同一个细胞）5 h。用GFP荧光观察突变h-Ras，用IF观察caveolin-KKSL，使用德克萨斯红-GAR。（C和F）在一个共转染的BFA处理的FRT细胞中，用抗PLAP和FITC-GAR（C）检测PLAP-HA，用抗myc和德克萨斯红-GAM（F）检测Cav-KKSL。
图3。
图3。
BFA诱导野生型和突变型小窝蛋白-1的LD积累。表达所示蛋白的FRT细胞用BFA处理5小时，小窝蛋白-1用IF检测。蛋白质按名称列出并以图表形式表示（不按比例）。NH2-小窝蛋白-1的末端、疏水性和COOH-末端结构域分别被图示为开盒、阴影盒和开盒。删除被图示为间隙，替换被图示为闭合三角形，7-Leu插入被图示为开放三角形。除了疏水结构域突变体（102A5–130A5），三角形的数量与变化的数量相对应。疏水域（Hyd D）、NH中的突变2-终端域（NTD）和COOH-终端域（CTD）分组在一起。照片。，这些蛋白质的IF图像如图4所示的面板所示。
图4。
图4。
野生型和突变型小窝蛋白-1在BFA处理的FRT细胞中的定位。（A） Caveolin-1；（B） Δ101-134；（C） 118A5；（D） 123A6；（E） Δ112-125；（F） Δ59；（G） Ins7L（1+2）；（H） Ins-7L1；（一） Ins-7L2；（J） Ins-14L；（K） Ins7L（1+2）+Δ112-125；和（L）ΔC。用BFA处理细胞5 h。用IF、抗磨维甲酸抗体和DTAF-GAR观察蛋白质。箭头，LD。箭头，GM130点状染色（未描绘），推测为内质网出口。
图5。
图5。
野生型和突变型caveolin-1和ADRP在BFA处理的FRT细胞中的定位。表达caveolin-1（A–C）、97/SASA（D–F）或Ins-7L（1+2）（G–I）的FRT细胞经BFA处理4h并固定甲醇。Caveolin和突变体通过IF检测，使用（A和G）德克萨斯红-GAR或（D）FITC-GAR。使用（B和H）DTAF-GAM或（E）德克萨斯红-GAM在转染细胞和相邻未转染细胞中检测ADRP。（C、F和I）合并图像。（A和B）黄色箭头表示一些重叠区域。
图6。
图6。
小窝蛋白-1突变体的表达水平与LD靶向性无关。用PLAP-HA（作为转染和负载对照）和Ins-7L1（泳道1）、Ins-7L2（泳道2）、Ins-7L（1+2）+Δ112-125（泳道3）、Δ59（泳道4）、Ins-7L（1+2）（泳道5）或Δ112-125（泳道6）共转染FRT细胞；或者，在单独的实验中，使用Ins-7L（1+2）（通道7）或ΔC（通道8）在单独的凝胶上进行分析。用凝胶负载缓冲液溶解细胞，用SDS-PAGE和Western blotting分析等等分溶解液中的蛋白质。切割印迹，用抗PLAP抗体探测顶部，用抗veolin抗体探测底部。用HRP–驴抗兔IgG对两半进行检测，并用ECL观察蛋白质。
图7。
图7。
KKSL标记的小窝蛋白-1突变体的定位。表达Ins-7L1-KKSL（A–C）、97/SASA-KXSL（D–F）、Ins-7L（1+2）-KKSI（G–I）或Ins-7L（1x2）+Δ112-125-KKSL的FRT细胞经甲醇固定。用IF检测同一细胞（B、E、H和K）中的Caveolin-1蛋白（A、D、G和J）和ADRP。（C、F、I和L）合并图像。蛋白质的示意图如图3所示，但只有两个三角形表示97/SASA中的四个替换，KKSL标签。
图8。
图8。
分离LDs中KKSL标记的小窝蛋白-1突变体。从油酸处理的表达Cav-KKSL、97/SASA-KKSL，Ins-7L（1+2）-KKSL或Ins-7L（1x2）+Δ112-125-KKSL的FRT细胞中分离出LDs。用SDS-PAGE和Western blotting分析LDs（LD）或保留5%的全细胞匀浆（WC）中的蛋白质并用ECL检测。印迹被切成三部分。顶部，用抗凝血酶和HRP-驴抗兔IgG进行探测。中间、抗ADRP和HRP-GAM。底部，抗磨维甲酸和HRP-驴抗兔IgG。蛋白质的示意图如图7所示。
图9。
图9。
模型描述了疏水螺旋堆积在LD靶向小窝蛋白-1中的作用。我们推测，小窝蛋白-1的疏水结构域形成两个α螺旋，由一个紧弯分开。（A） 我们认为，野生型小窝蛋白-1的LD靶向需要正确包装假定的疏水螺旋。（B） 在两个螺旋中插入笨重的亮氨酸残基可以通过阻止适当的螺旋堆积来抑制LD的立体靶向。（C） 小窝蛋白-1疏水结构域前半部分的螺旋轮描绘（膜界面处的R101[下划线]至Y119[*]）。富含Gly+Ala的螺旋面上的圆圈和残留物。（D） HCV Glasgow株（基因型1a；Hope和McLauchlan，2000）核心编码区的L144（下划线）到A165，位于P138+P143基序的下游，被建模为α螺旋。富含Gly+Ala的螺旋面上的圆圈和残留物。方形，带电残渣。
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参考文献

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