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.2004年1月；24（2）：924-35。
doi:10.1128/MCB.24.24~935.2004。

半胱氨酸蛋白酶2和8介导HOXA5诱导乳腺癌细胞凋亡

陈和欣 1, 承中, 萨拉斯瓦提·苏库马尔
附属机构

半胱氨酸蛋白酶2和8介导HOXA5诱导乳腺癌细胞凋亡

陈和欣等人。 摩尔细胞生物学. 2004年1月.

摘要

HOXA5是一种转录因子，在60%以上的乳腺癌中表达缺失。我们之前的研究表明，HOXA5在MCF7细胞中的过度表达通过p53依赖性凋亡途径导致细胞死亡。为了确定p53诱导的凋亡途径是否参与HOXA5诱导的细胞死亡，我们设计了一个p53突变乳腺癌细胞系Hs578T，以诱导表达HOXA5。HOXA5表达的诱导导致细胞死亡，其特征是24小时内出现典型的凋亡，突变型p53及其靶基因的表达水平下降或保持不变。为了破译凋亡途径，用多种凋亡抑制剂处理HOXA5表达细胞。除了一般的caspase抑制剂外，caspase 2和8特异性抑制剂在很大程度上消除了HOXA5诱导的凋亡，而caspase 1、3、6和9特异性抑制剂没有显著作用。Western blot分析进一步证实，诱导HOXA5表达后，caspases 2和8被激活。此外，一些特异性沉默caspase 2和caspase 8表达的小干扰RNA显著阻断HOXA5诱导的细胞凋亡。HOXA5的表达也可以使细胞对肿瘤坏死因子α诱导的凋亡至少敏感100倍。这些结果表明，HOXA5的表达可以通过半胱氨酸蛋白酶2和8介导的凋亡机制诱导细胞凋亡。

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数字

图1。
图1。
成立泰特-非诱导HOXA5细胞系。（A） 用于转染乳腺癌细胞系Hs578T细胞的构建物。（B） 筛选GFP诱导表达的稳定克隆。多西环素（DOX）是四环素的类似物。从培养基中去除DOX诱导了增强型GFP（EGFP）和HOXA5的表达。（C） Western blot分析HOXA5诱导克隆10中HOXA5表达诱导的时间进程。V（V）0和V24表示诱导后0和24小时从载体转染细胞中提取的细胞裂解物。
图2。
图2。
诱导HOXA5表达导致细胞死亡。（A） HOXA5-和载体诱导克隆在存在或不存在强力霉素（DOX）的情况下培养24小时。在显微镜下拍摄细胞照片（放大倍数×10）。（B） MTT法测定活细胞的相对数量。HOXA5-和载体诱导细胞在DOX存在或不存在的情况下培养。每24小时测量一次细胞活力年轴表示活细胞的相对数量，与第一次从培养基中取出DOX时第0天的数量相比。由于未诱导的细胞和载体转染的细胞继续生长，诱导24至96小时后细胞数量增加。
图3。
图3。
HOXA5通过凋亡诱导细胞死亡。（A） DNA片段分析。从诱导后0、9和24小时收获的HOXA5诱导细胞中提取DNA片段，然后在1%琼脂糖凝胶上分离。（B） 膜联蛋白V染色后的流式细胞术分析。在诱导后0、24和48小时收集转染载体和HOXA5的细胞并进行计数。电池（4×105)每个样本用PE结合的膜联蛋白V染色30分钟，然后用流式细胞仪进行分析。在门控盒中显示Annexin V阳性细胞，并显示百分比。FSC，前向散射。（C） HOXA5诱导后细胞周期分布的流式细胞术分析。在诱导后0、12、24、48和h收集HOXA5诱导细胞，并进行流式细胞术分析。子G0/G公司1细胞群（M1）代表凋亡细胞。子G0/G公司1还显示了百分比。
图4。
图4。
HOXA5诱导的细胞凋亡是p53依赖性的。HOXA5诱导细胞在诱导后0、3、6、9、24和48小时收获。使用20微克的全细胞裂解物对p53及其靶基因MDM2和BAX的表达进行蛋白质印迹分析。五、 载体转染细胞裂解物。
图5：。
图5：。
Z-VAD-FMK抑制HOXA5诱导的细胞凋亡。（A） 不同浓度的Z-VAD-FMK抑制HOXA5诱导的细胞凋亡。从培养基中去除强力霉素（DOX）后，用浓度为10μM、25μM、50μM和100μM的Z-VAD-FMK处理HOXA5诱导细胞24 h。凋亡细胞死亡（亚G0/G公司1)如前所述，通过流式细胞仪分析进行测量。（B） HOXA5诱导细胞在DOX和100μM Z-VAD-FMK存在或不存在的情况下培养24 h。（C）通过MTT法测定活细胞的相对数量。在未诱导条件（+DOX）下生长24小时后，用以下DOX和ZVAD组合处理细胞：。每24小时测量活细胞的相对数量，并与0小时的数量进行比较。此处显示的数据表示每个时间点用三个重复微孔进行的两个独立实验的平均值。
图6：。
图6：。
HOXA5表达的诱导导致caspase 2和caspase 8的激活。（A） 不同caspase抑制剂对HOXA5诱导的细胞凋亡的影响。Casp1in，Z-YVAD-FMK；Casp2in，Z-VAVAD-FMK；Casp3in，Z-DEVD-FMK；酪蛋白6in，Z-VEID-FMK；Casp8in，Z-IETD-FMK；壳体9in，Z-LEHD-FMK。BA使用浓度为50μM，DPQ使用浓度为30μM。所有其他抑制剂均以100μM的浓度使用。HOXA5在没有抑制剂治疗的情况下诱导的细胞死亡被称为100%的细胞凋亡。（B） HOXA5诱导后procaspase（Pro-Casp）2的时间依赖性裂解。（C） HOXA5诱导后procaspase 8的时间依赖性裂解。（D） caspase（Casp）2样、caspase 3样和caspase 8样活性的时间进程诱导。在指定的时间提取蛋白质，并测量半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性作为OD的吸光度405与caspase 2（Ac-VAVAD-pNA）、caspase 3（Ac-DEVD-pNA）和caspase 8（Ac-IETD-pNA。外径405s标准化为蛋白质量。（E） 通过体外测试，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂对半胱氨酸蛋白酶2-、3-和8-样活性的影响。从未诱导和诱导的细胞以及用100μM Casp1in、Casp2in、Casp3in、Casp 8in、Casp9in和ZVAD（Z-VAD-FMK）处理的诱导细胞制备细胞裂解液24小时。每个裂解液被分成三部分，用于测定caspase 2-、3-和8-样活性。
图7。
图7。
半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶2在HOXA5诱导细胞凋亡中的需求。（A） siRNA对caspase 2表达的特异性抑制。用siRNA将HOXA5诱导的细胞转染到层粘连蛋白、caspase 1（Casp1）和caspase 2中（Casp2）。在转染后48小时，制备全细胞裂解物，并通过Western blot分析测定procasase 2（Pro-Casp2）和procaspase 8（Pro-Casp8；一种对照caspase）的表达水平。（B） caspase 2的siRNA抑制HOXA5诱导的细胞凋亡。将siRNAs重复转染到Hs578T-HOXA5细胞中。转染后48小时，从一组转染细胞的培养基中去除多西环素（−DOX），并将其留在另一组细胞的培养液中（+DOX）。在表达式之后HOXA5型再诱导16小时，凋亡细胞百分比（亚G0/G公司1人群）通过流式细胞仪分析进行测量。（C） siRNA对caspase 8（Casp8）表达的特异性抑制。用siRNA将HOXA5诱导的细胞转染到caspase 8。如上文所述，转染四个caspase siRNA，其靶序列显示在材料和方法部分。（D） caspase 8的siRNA抑制HOXA5诱导的细胞凋亡。
图8。
图8。
HOXA5和TNF-α协同激活细胞凋亡。（A） TNF-α诱导Hs578T细胞凋亡需要另一种协同刺激物，如放线菌酮（CHX）。在存在或不存在环己酰亚胺（1μg/ml）的情况下，用不同浓度的TNF-α处理细胞24 h，然后通过流式细胞仪分析测定细胞凋亡。（B） HOXA5表达的诱导增强了TNF-α诱导的细胞凋亡。在诱导（无强力霉素[-DOX]）或未诱导（+DOX）条件下培养的细胞用相同浓度的TNF-α处理24 h，然后测量细胞凋亡。（C） caspase抑制剂抑制TNF-α诱导的细胞凋亡。使用TNF-α（50 nM）和1μg环己酰亚胺/ml诱导细胞凋亡24小时。使用图6图例中描述的抑制剂（每种浓度为100μM）。C2，caspase 2抑制剂；C3，caspase 3抑制剂；C8，caspase 8抑制剂；ZV、Z-VAD-FMK。（D） caspase抑制剂抑制HOXA5-和TNF-α诱导的细胞凋亡。
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