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.2003年12月；1（3）：E60。
doi:10.1371/journal.pbio.0000060。 Epub 2003年10月13日。

果蝇MicroRNA靶点的鉴定

亚历山大·斯塔克 1, 朱利叶斯·布伦内克, 罗伯特·拉塞尔, 史蒂芬·M·科恩
附属公司

果蝇MicroRNA靶点的鉴定

亚历山大·斯塔克等。 公共科学图书馆生物. 2003年12月.

摘要

微RNA（miRNAs）是一种短RNA分子，通过与靶信使RNA结合并控制蛋白质的产生或导致RNA断裂来调节基因表达。迄今为止，数百种已识别的miRNAs中只有少数被指定了功能，部分原因是难以识别其靶点。miRNAs的长度较短，并且它们与靶序列的互补性不完善，这意味着无法通过标准的序列比较方法在动物基因组中识别靶序列。在这里，我们从果蝇基因组中筛选保守的3'UTR序列，以寻找潜在的miRNA靶点。筛选过程将序列搜索与预测的miRNA-靶异源双链结构和能量的评估相结合。我们表明，该方法成功地从一个大型数据库中识别了五个先前验证过的let-7、lin-4和bantam靶点，并预测了果蝇miRNAs的新靶点。我们的靶点预测揭示了特定miRNAs的顶级预测中功能相关靶点的惊人集群。其中包括miR-7的Notch靶基因、miR-2家族的促凋亡基因以及miR-277代谢途径中的酶。我们通过实验验证了miR-7和miR-2家族的三个预测靶点，使动物miRNA的验证靶点数量增加了一倍。统计分析表明，最佳单预测靶点位于显著性边界；因此，在实验验证之前，目标预测应被视为暂时性的。我们确定了所有经验证的靶点共享的特征，这些特征可用于评估动物miRNAs的靶点预测。我们对靶点预测的初步评估和实验验证表明了两种miRNAs的功能。对其他人来说，屏幕显示了一些看似合理的功能，例如miR-277作为控制氨基酸分解代谢的代谢开关的作用。跨基因比较被证明是必要的，因为它可以减少序列搜索空间。基因组注释的改进和来自其他基因组的cDNA序列的可用性的增加将允许更灵敏的筛选。预计确认目标数量的增加将揭示可用于改进其检测的一般结构特征。虽然屏幕可能会漏掉一些目标，但我们的研究表明，仅凭序列就可以识别出有效的目标。

PubMed免责声明

利益冲突声明

提交人声明，不存在利益冲突。

数字

图1
图1。已知miRNA靶序列的特征
（A） miRNA靶基因3′UTR序列保守性比较。对于第14行,第28行,林-41、和林-57比较了秀丽线虫和布里格斯线虫。对于隐藏比较黑腹果蝇和假暗腹果蝇。白色区域表示保守，而黑色区域在用于生成3′UTR数据库的条件下不保守（有关详细信息，请参见材料和方法）。文献中预测的miRNA靶位点的位置以红色显示。大多数这些UTR包含多个预测的靶序列，虽然UTR的调节在每种情况下都已通过实验验证，但大多数单个位点尚未进行功能测试。（B） 详细比较保守位点的序列保护模式。靶位点长度为miRNA长度加5个核苷酸林-57我们排除了8个先前预测的不位于保守序列块的位点中的3个，并包括一个新发现的第9个保守位点。黑色上的白色表示两个基因组中目标位点的残基不相同。白色上的黑色表示身份。所有与miRNA第2-8位碱基配对的残基在两个基因组的保守位点中都是相同的。
图2
图2。miRNA靶点预测策略
（A）let-7,林-4、和矮脚鸡显示与已知靶点碱基配对模式的miRNA序列。黄色表示常规基对。橙色表示G:U基对。蓝色表示不匹配。黑色条表示目标序列中循环的位置。注意，在目标序列中形成循环的额外碱基没有显示。序列以miRNA的长度显示。（B）来自（A）的数据定量。这一比较表明，miRNA的5′端总是与靶序列良好配对，并表明搜索miRNA的前8个残基的互补性将选择所有已知的靶点。（C） Mfold输出的图形表示矮脚鸡miRNA和3′UTR的靶位点隐藏基因.要使用Mfold，有必要使用发夹形成的连接序列将预测的靶位点（红色）和miRNA（蓝色）连接到一个序列中。在本例中，目标序列和miRNA的长度相同，因此预测目标序列尾部的额外5 nt不显示。（D） 10000个随机序列（绿色）和预测目标的多重自由能分布图矮脚鸡miRNA（红色）。X轴：按Mfold计算每个场地的ΔG。
图3
图3。的实验验证miR-7型目标
（A） 的示意图E（标准普尔）和英国基因复合体，包含多个预测miR-7基因靶基因。bHLH型转录抑制因子显示为红色。Brd型蛋白显示为蓝色。其他成绩单E（标准普尔）集群为灰色。黑色星号表示前八个残基中没有错配的位点（可能是有效位点）。（B）miR-7型miRNA序列显示与靶位点碱基配对的模式E（标准普尔）和英国复杂基因按预测折叠能量的顺序排序。黄色表示常规碱基对。橙色表示G:U基对。蓝色表示不匹配。黑色条表示回路在目标站点中的位置。（C） 的表达式miR-7型传感器转基因显示为绿色。红色荧光蛋白的表达miR-7型ptc–Gal4控制下的miRNA显示为红色。右侧面板显示miR-7型仅传感器。（D和E）4米3′UTR和多毛的3′UTR传感器转基因（绿色）被下调miR-7型（红色）。的表达式多毛的3′UTR传感器比4米整体3′UTR传感器。切割蛋白（以蓝色显示）在miR-7基因表达细胞。右侧面板显示了切割压制的第二个示例。下部面板仅显示“剪切通道”。（F） 的ClustalW对齐miR-7型3′UTR中的目标站点多毛的来自几个物种。星号表示序列同一性。黑色类型通过Mfold表示碱基对（包括G:U碱基对）。灰色阴影突出显示了所有五种物种中保守的miRNA-靶结合区域。（G） 野生型成虫翅膀的角质层制备和表达miR-7型在ptc–Gal4控制下，在第3和第4静脉之间的区域。注意机翼的切口以及静脉3和静脉4之间区域的缩小，导致近端部分融合。后室的大小明显增大，以补偿静脉3-4区的缩小。
图4
图4。的实验验证miR-2型目标
（A） 3′UTR序列的保守性收割机,严峻的、和镰刀黑腹果蝇和假盲果蝇的基因。高序列相似性的块是彩色编码的。预测的位置miR-2/miR-13家庭目标站点用黑色下划线。（B） 预测的ClustalW对齐miR-2/miR-13家庭目标站点收割机,严峻的、和镰刀3英尺UTR。Z轴的分数miR-2a和miR-2b为每个站点显示。The first bases of the严峻的和镰刀这些位点不与miRNAs配对。因为我们使用了发夹形成的连接子序列，这会导致Mfold中的惩罚，从而降低这些站点Z轴得分超过了应有的水平。（C） 转染以表达微管蛋白启动子-EGFP-收割器3′UTR构建体（泳道2）或类似构建体的S2细胞的免疫印迹miR-2/miR-13-删除了UTR中的绑定站点（第3条车道）。对照细胞转染空载体（1号通道）。首先用GFP抗体检测印迹，然后用抗微管蛋白作为负荷对照。（D和E）严峻的和镰刀3′UTR传感器转基因（绿色）被下调miR-2b在ptc–Gal4对照下表达（红色）。
图5
图5。预测目标的统计评估
的绘图E类-值作为折叠自由能的函数。Y轴：的对数刻度E类-值。X轴：以Mfold计算的折叠自由能。一个、两个和四个站点的计算分别显示。最好的位置矮脚鸡站点位于隐藏显示供参考。
图6
图6。缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸分解代谢途径
酶鉴定为miR-277型目标被装箱并通过CG编号识别。需要红色方框Z轴>3英寸按蚊.需要蓝色方框Z轴>2英寸按蚊除了预测的靶标外，在果蝇属以绿色阴影显示。代谢途径图来自http://www.genome.ad.jp/kegg/pathway/map/map00280.html.
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