Differential roles of hypoxia-inducible factor 1alpha (HIF-1alpha) and HIF-2alpha in hypoxic gene regulation

doi:10.1128/MCB.23.24.9361-9374.2003

.2003年12月；23(24):9361-74.

doi:10.128/MCB.23.24.9361-9374.2003。

低氧诱导因子1alpha（HIF-1α）和HIF-2α在低氧基因调控中的差异作用

胡成军¹, 王立毅, 刘易斯·乔多什, 布莱恩·基思, M Celeste Simon先生

附属公司

PMID： 14645546
预防性维修识别码： PMC309606型
内政部： 10.1128/MCB.23.24.9361-9374.2003

低氧诱导因子1alpha（HIF-1α）和HIF-2α在低氧基因调控中的差异作用

胡成军等。分子细胞生物学. 2003年12月.

.2003年12月；23(24):9361-74.

doi:10.1128/MCB.23.24.9361-9374.2003。

作者

胡成军¹, 王立毅, 刘易斯·乔多什, 布莱恩·基思, M Celeste Simon先生

附属

¹艾布拉姆森家族癌症研究所。美国宾夕法尼亚大学医学院霍华德·休斯医学院，宾夕法尼亚州费城居里大道421号，邮编：19104。

PMID： 14645546
预防性维修识别码： PMC309606型
内政部： 10.1128/MCB.23.24.9361-9374.2003

摘要

低氧诱导因子（HIF）、HIF-α的异二聚体和芳香烃受体核转位亚单位主要介导低氧转录反应。HIF-1α和HIF-2α亚单位在DNA结合和二聚体结构域上结构相似，但在转录激活域上不同，这意味着它们可能具有独特的靶基因。先前使用Hif-1alpha（-/-）胚胎干细胞和小鼠胚胎成纤维细胞的研究表明，Hif-1alpha-的缺失消除了所有分析的氧调节转录反应，表明Hif-2alpha对缺氧基因调节是不必要的。相反，在瞬时转染试验中以及在肺和其他组织的胚胎发育过程中，HIF-2alpha被证明可以调节一些低氧诱导基因。为了解决这个差异，并确定特定的HIF-2alpha靶基因，我们使用DNA微阵列分析来评估表达HIF-2alpha但不表达HIF-1alpha的细胞中的缺氧基因诱导。此外，我们设计HEK293细胞，通过四环素调节启动子表达稳定形式的HIF-1α或HIF-2α。在HIF-1alpha和HIF-2alpha靶基因的首次比较研究中，我们证明HIF-2alpha确实调节多种广泛表达的低氧诱导基因，这表明其功能并不像最初认为的那样局限于内皮细胞特异性基因表达。重要的是，HIF-1alpha（而非HIF-2alpha）刺激这两种细胞中的糖酵解基因表达，首次明确表明HIF-1alpha和HIF-2alpha具有独特的靶点。

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数字

**图1。**
786-O细胞表达HIF-2α，但不表达HIF-1α。786-O（PRC-3）是一个*VHL（甚高频）*-肾癌细胞系缺陷，而786-O（WT-8）细胞已稳定转染功能性*VHL（甚高频）*(38). RCC-4是另一个*VHL（甚高频）*-突变型肾癌细胞系，同时表达HIF-1α和HIF-2α。RCC-4（T3-14）细胞已被稳定转染*VHL（甚高频）*HIF-1αmRNA表达增强*VHL（甚高频）*-转染的RCC-4细胞之前已经被观察到（55）。低氧（H）治疗（1.5%O₂16 h）稳定786-O（WT-8）细胞中的HIF-2α蛋白，并稳定RCC-4（T3-14）细胞的HIF-1α和HIF-2阿尔蛋白，如HIF-1和HIF-1阿尔蛋白印迹所示。ARNT Western blot作为蛋白质负荷对照。

**图2。**
通过Northern blot分析确认DNA微阵列数据。（A）缺氧（H）（1.5%O₂16 h）刺激786-O（WT-8）和RCC-4（T3-14）细胞中ADRP、NDRG-1、ADM和VEGF的表达，并且可能依赖于HIF，因为这些基因在亲代786-O细胞（PRC-3）和RCC-4细胞中过度表达，而不依赖于O₂严重缺氧（SH）（0.1%O₂与1.5%O相比，16 h）进一步增强缺氧基因表达₂GADD45A和CHOP是低氧反应基因，但与HIF活性无关。（C）编码四种糖酵解酶的PGK-1、LDHA、PGM-1和PKM mRNA不受低氧处理（1.5或0.1%O）的刺激₂)786-O细胞，但在RCC-4细胞中诱导。

**图3。**
HIF-1α与多种细胞类型中糖酵解基因的低氧诱导有关。（A）两种原代内皮细胞系和三种转化细胞系中HIF-1α和HIF-2α表达的Northern blot分析。HIF-1α在所有五个水平相似的细胞系中表达，而HIF-2α在两个内皮细胞中高表达。（B）用低氧灭活DFX（100μM）处理细胞6 h后，HIF-1α和HIF-2α蛋白的Western blot分析。HIF-1和HIF-2α蛋白表达水平与其mRNA水平基本一致，HMVEC-L细胞和Hep3B细胞中HIF-1 a和HIF-1 2α的水平除外。（C）缺氧处理（1.5%O₂16 h）增加糖酵解基因（PGK和LDHA）和HIF-2α诱导基因（NDRG-1和VEGF）在所有五种细胞系中的表达。

**图4。**
786-O细胞中HIF-1α的表达可恢复糖酵解基因对缺氧处理的反应。（A）稳定转染HIF-1α的786-O（WT-8）克隆的建立和鉴定。如HIF-1αNorthern印迹和Western印迹分析所示，WT-8L细胞表达低水平的HIF-1α，而WT-8H细胞表达高水平的HIF-1α。pcDNA3载体转染的对照WT-8V细胞和亲代WT-8细胞不表达HIF-1αRNA或蛋白。HEK293细胞的内源性HIF-1αmRNA（星号）比转染的HIF-1βmRNA（双星号）大，作为HIF-1蛋白的阳性对照。（B）对HIF-1α挽救的WT-8细胞中两个糖酵解基因的Northern blot分析表明，用1.5%O处理后，WT-8H细胞中诱导了LDHA和PGK-1₂持续16 h。内源性HIF-1α对WT-8H细胞的诱导水平与对HEK293细胞的诱导程度相当。

**图5：。**
羟化脯氨酸的突变赋予正常氧细胞HIF-1α和HIF-2α功能。（A） HIF-1α和HIF-2α单脯氨酸和双脯氨酸突变体的示意图。（B）双脯氨酸HIF-1α和HIF-2α突变体在正常氧环境下稳定₂紧张。将转染野生型单脯氨酸突变体和双脯氨酸突变型HIF-α亚基的HEK293-T细胞分成两个培养皿，其中一个培养皿在核提取前用DFX处理6h。用特异性抗体通过Western blot分析测定HIF-α蛋白的量，并显示一条非特异性（NS）带用于蛋白质负荷控制。（C） HIF-α双脯氨酸突变体在正常毒性细胞的野生型（WT）-HRE-Luc报告转录激活试验中高度活跃。突变型（MT）-HRE-Luc报告子不受HIF-1α或HIF-2α调节。

**图6。**
HIF-1αDPA和HIF-2αDPA克隆上HEK293 TET的建立。（A）多西环素对HIF-αmRNA的表达有严格的调节作用。Northern blot分析HIF-1αDPA克隆130（左）上HEK293 TET中HIF-1 a和HIF-2αmRNA的表达以及HIF-2 a DPA克隆63（右）上HEK 293 TET-用不同剂量的强力霉素处理20小时HIF-2αDPA克隆上两个独立的HEK293 TET中HIF-2βmRNA和蛋白的表达（右）。Dox公司。浓度。，强力霉素的浓度。

**图7。**
HIF-1α而非HIF-2α刺激HEK293 TET-on细胞中编码糖酵解酶的基因。（A） HEK293 TET中两个糖酵解基因和两个HIF-2α应答基因在HIF-1αDPA克隆上的Northern blot分析，用1μg多西环素/ml处理20 h（+），没有强力霉素。HIF-1α增加所有四个基因的转录。（B）在用1μg强力霉素/ml处理20小时的HIF-2αDPA克隆上，HEK293TET中两个糖酵解基因和两个HIF-2α响应基因的Northern印迹分析。HIF-2α诱导NDRG-1和VEGF表达，但不诱导糖酵解基因表达。（C）添加强力霉素（1μg/ml）会增加HIF-1DPA克隆上HEK293 TET的葡萄糖使用量，但不会增加HIF-2DPA克隆上的HEK293TET或亲代细胞上的HEk293TET-的葡萄糖使用。葡萄糖用量的百分比变化被定义为[葡萄糖（−Dox）−葡萄糖（+Dox）]/葡萄糖（–Dox）。（D）多西环素治疗（1μg/ml，48小时）增加HIF-1DPA和HIF-2DPA克隆上HEK293 TET中VEGF蛋白的分泌。

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