Role of fusion protein cleavage site in the virulence of Newcastle disease virus

doi:10.1016/j.micpath.2003.07.003

.2004年1月；36(1):1-10.

doi:10.1016/j.micpath.2003.07.003。

融合蛋白裂解位点在新城疫病毒毒力中的作用

Aruna熊猫¹, 黄竹辉, 苏比亚·埃兰库马兰, 丹尼尔·洛克曼, 锡巴K萨马尔

附属机构

PMID： 14643634
预防性维修识别码： PMC7125746号
DOI（操作界面）： 2016年10月10日/j.micpath.2003.07.003

融合蛋白裂解位点在新城疫病毒毒力中的作用

Aruna熊猫等。微生物致病. 2004年1月.

.2004年1月；36(1):1-10.

doi:10.1016/j.micpath.2003.07.003。

作者

Aruna熊猫¹, 黄竹辉, 苏比亚·埃兰库马兰, 丹尼尔·洛克曼, 锡巴K萨马尔

附属

¹马里兰大学弗吉尼亚-马里兰地区兽医学院，美国马里兰州大学公园格林米德大道8075号，邮编：20742。

PMID： 14643634
预防性维修识别码： PMC7125746号
DOI（操作界面）： 2016年10月10日/j.micpath.2003.07.003

摘要

新城疫病毒（NDV）在家禽中引起一种具有高度传染性和经济重要性的疾病。新冠病毒毒力的病毒决定因素尚不完全清楚。融合蛋白（F）蛋白酶切割位点的氨基酸序列被认为是NDV毒力的主要决定因素。在本研究中，我们利用反向遗传学技术检测了F蛋白裂解位点序列在NDV毒力中的作用。将无毒菌株LaSota F蛋白裂解位点的序列G-R-Q-G-R突变为神经毒力菌株Beaudette C（BC）F裂解位点的R-R-Q-K-R。由此产生的突变LaSota V.F.病毒在细胞培养中不需要外源蛋白酶进行感染，这表明F蛋白被细胞内蛋白酶裂解。通过鸡脑内致病性指数（ICPI）和静脉内致病性指标（IVPI）试验，在体内评估突变病毒和亲本病毒的毒力。我们的结果表明，F蛋白裂解位点的修饰导致了毒力的急剧增加，从LaSota的ICPI值0.00增加到LaSota V.F.的1.12。然而，LaSota 5.F.的ICPI数值低于BC，后者的值为1.58。有趣的是，IVPI测试显示LaSota和LaSota V.F.病毒的值均为0.00，而BC的IVPI值为1.45。还研究了病毒的体外特性。我们的结果表明，如果NDV直接进入鸡的大脑，F蛋白的裂解效率起着重要作用，但可能还有其他病毒因素影响外周复制、病毒血症或进入中枢神经系统。

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图1
图中显示了rBC、rLaSota和rLaSotaV.F.病毒的基因组。将rLaSota的F蛋白裂解位点的氨基酸序列突变为rBC的氨基酸序列，获得rLaSotaV.F.病毒。体外繁殖所需的胰蛋白酶如侧面所示。

图2
（A） rBC、rLaSota和rLaSota-V.F.病毒在DF1细胞中的多步生长曲线。25厘米的单层细胞²烧瓶感染0.05 PFU/细胞，每个病毒三个重复烧瓶。每8小时采集一次上清液样本，持续56小时。通过菌斑试验滴定上清液中的病毒。感染rLaSota的细胞培养基含有1μg/ml乙酰-胰蛋白酶。（B） rBC、rLaSota和rLaSota-V.F的菌斑大小和形态。对病毒进行连续稀释，并将每孔100μl的连续稀释液添加到12孔板中汇合的DF1细胞中。每个病毒样本的每次连续稀释都使用了双微孔。吸附60分钟后，用DMEM覆盖细胞（含2%胎牛血清和0.9%甲基纤维素），并在37°C下培养3-4天。然后用乙醇固定细胞，并用结晶紫染色以观察斑块。

图3
NDV株rBC、rLaSota和LaSota V.F.在1日龄雏鸡脑内接种10^三病毒PFU。每天收集活禽的大脑，均质并分析斑块中的病毒含量。

图4
（A） 37°C和41.5°C下鸡神经细胞rBC的多阶段生长曲线。将病毒以0.05的m.o.i接种到鸡神经细胞中，并保持在37和41.5°C。通过DF 1细胞上的斑块试验测定24、48和72小时的病毒滴度。（B） 37和41.5°C下Vero细胞中rBC的多阶段生长曲线。将病毒以0.05的m.o.i.接种到Vero细胞中，并保持在37和41.5°C。每隔8小时收集上清液，直到56小时P.I.。通过对DF 1细胞的噬斑测定来测定病毒滴度。

图5
（A）从10天龄的鸡胚中制备鸡神经细胞。在培养基中添加Ara C以抑制非神经元细胞的生长。神经元细胞的身份通过使用人神经丝200 kDa抗体的免疫染色得到确认（新泽西州研究诊断公司）。用0.01 m.o.i.的病毒接种鸡神经细胞。感染后72小时，细胞固定并用苏木精-伊红染色。放大×20.（B）用链霉亲和素胶体金检测纯化生物素化病毒在4°C下与鸡神经元细胞单层的结合。通过对未标记NDV的结合位点进行竞争试验来确定结合的特异性。放大倍数×20。

图6
代表性器官中的病毒滴度（PFU/g组织，PFU/mL血液）。将rBC、rLaSota或rLaSotaV.F.病毒（10^三PFU/鸡肉）。在感染后第1、3、5和7天处死鸡，取下组织，匀浆并通过菌斑试验进行滴定。

图7
（a）原位杂交以定位rBC、rLaSota或rLaSota-V.F.病毒的感染部位。三周龄鸡经鼻感染10只^三病毒PFU。在感染后1、3、5和7天，处死鸡并灌注4%多聚甲醛。大脑沿中线矢状切开，石蜡包埋，切片5μm/切片。切片进行原位杂交³⁵S标记的核糖探针对NDV的NP基因或牛RSV的P基因具有特异性。无论是模拟感染鸡还是牛RSV探针均未观察到特异性信号。所示为感染后第5天小脑感染rBC（D P.I.）（A）和第7天小脑（B）的代表性切片，以及感染LaSota V.F.病毒后第7天（C）小脑的代表性截面。（b）感染rBC、rLaSota或rLaSotaV.F.病毒雏鸡大脑的免疫组织化学。三周龄鸡经鼻感染10只^三病毒PFU。在感染后1、3、5和7天，处死鸡并灌注4%多聚甲醛。大脑沿中线矢状切开，石蜡包埋，切片5μm/切片。用NDV HN蛋白单克隆抗体鸡尾酒检测NDV抗原的存在。（A） rBC病毒感染的大脑在7DPI时小脑中显示病毒抗原染色的斑块状区域。（B）rLaSota V.F.病毒感染的脑在7DPI.时小脑没有显示病毒抗原。

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1. 亚历山大·D·J·纽卡斯尔病。美国鸟类病理学家协会，肯德尔/亨特出版公司；爱荷华州杜布克：1989年。（摘自：禽类病原体分离和鉴定实验室手册）。第114-120页。
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1. Peeples M.E.新城疫病毒复制。作者：Alexander D.J.，编辑。纽卡斯尔病。Kluwer学术出版社；多德雷赫特：1988年。第45-78页。
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