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.2003年11月25日；100(24):13940-5.
doi:10.1073/pnas.1936192100。 Epub 2003年11月13日。

通道视紫红质-2，一种直接光控阳离子选择性膜通道

格奥尔格·纳格尔 1, Tanjef Szellas公司, 沃尔夫拉姆·胡恩, Suneel Kateriya公司, 诺娜·阿迪什维利, 彼得·伯特霍尔德, 多丽丝·奥利格, 彼得·海格曼, 恩斯特·班贝格
附属公司

通道视紫红质-2，一种直接光控阳离子选择性膜通道

乔治·纳格尔等。 美国国家科学院程序. .

摘要

微生物型视紫红质存在于古生菌、原核生物和真核生物中。其中一些代表膜离子转运蛋白，如细菌视紫红质（一种光驱动质子泵）或通道视紫红蛋白-1（ChR1），一种最近从绿藻莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）中发现的光门控质子通道。ChR1和ChR2，一种来自C.reinhardtii的相关微生物型视紫红质，被证明参与了这种绿藻光电流的产生。我们通过在非洲爪蟾卵母细胞和哺乳动物细胞中的功能表达证明，ChR2是一种直接光开关的阳离子选择性离子通道。该通道在光子被吸收后迅速打开，从而对单价和二价阳离子产生较大的渗透率。ChR2在连续光下对较小的稳态电导脱敏。细胞外H+和负膜电位加速脱敏恢复，而细胞内H+则减缓ChR2离子通道的关闭。ChR2在低光条件下主要在莱茵哈迪梭菌中表达，表明参与了暗适应细胞的光感受。预测的ChR2的七跨膜α螺旋是G蛋白偶联受体的特征，但反映了阳离子选择性离子通道的不同基序。最后，我们证明了ChR2可以简单地通过光照使小细胞或大细胞去极化。

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数字

图1。
图1。
ChR2–315介导的光激活电导的离子依赖性。全长ChR2–737的光电流无法区分。(一)ChR2–737和ChR2–315的预测结构方案。(b条)在林格溶液（110 mM NaCl、5 mM KCl、2 mM CaCl）中表达ChR2–315的卵母细胞的双电极电压灯记录2，1 mM氯化镁2pH值7.6）。蓝色（450±25 nm）光的照明由灰色条指示。电流是其他23个实验中的典型电流。(c（c）)在同一卵母细胞中测量的115 mM盐溶液（LiCl、NaCl、KCl、RbCl、CsCl和NMG-Cl）在–100 mV、pH 7.6下的归一化向内光电流。电流是其他四个实验中的典型电流。(d日)在pH 9、pH 7.6或pH 5的115 mM NMG-Cl中，来自同一卵母细胞的–100 mV光电流。电流是其他三个实验中的典型电流。(e（电子）)一个代表性卵母细胞（从上到下）的稳态光电流的电流-电压关系：115 mM NMG-Cl，pH 9；80 mM氯化镁2，pH 9（电流-电压，如NMG，pH 9）；115 mM氯化锂，pH 9；110 mM氯化钠，5 mM氯化钾，pH 7.6。电流是其他三个卵母细胞的典型电流。(（f）)根据取代Na时光电流的反转电位（31）变化得出的不同单价阳离子的渗透率比+通过阳离子X+使用的溶液为：115 mM XCl、2 mM BaCl2，1氯化镁2pH值为9。H的渗透率+由Goldmann–Hodgkin–Katz方程（31）根据115 mM NMG-Cl在pH 9下的光电流反转电位估算，假设细胞质≈100 K+和酸碱度我第7.3页。n个= 3. (克)80 mM CaCl中的光电流2–100毫伏时pH9(下部和插入，更高的时间分辨率）。然后，给卵母细胞注射1,2-二（2-氨基苯氧基）乙烷-N个,N个,N个’，N个四乙酸（BAPTA）（作为K盐）达到最终浓度10 mM，并再次测定光电流(上部和插入). 电流是其他四个实验中的典型电流。(小时)瞬时表达ChR2–315的HEK293细胞的光电流。在–100、–50、0、+50和+100 mV下测定光电流。使用的移液管溶液为140 mM NaCl、5 mM EGTA、2 mM MgCl2，10 mM Hepes，pH 7.4。使用的镀液为140 mM NaCl，2 mM MgCl2，1 mM氯化钙2，10 mM Hepes，pH 7.4。电流是HEK293上其他九个以上实验和BHK电池中五个以上实验的典型电流。
图2。
图2。
光电流脱敏的恢复是电压和pH值o（o）依赖。电流是其他三个实验中的典型电流。(一——c（c）)两个暗相为10 s的光脉冲，pH值o（o）7.6，相同卵母细胞在–120 mV下(一)，-40毫伏(b条)和+40毫伏(c（c）). (d日)另一个pH值的卵母细胞o（o）7.4，+20 mV，光脉冲之间暗32秒。(e（电子）)相同的卵母细胞，pHo（o）= 5.5. (（f）)与中的卵母细胞相同d日和e（电子），pH值o（o）闪光期间为7.4，但pH值为o（o）=5.5，黑暗阶段持续20 s。光脉冲由灰色条表示。(克)ChR2–315-E123D在–100 mV，pH 7.6下的光电流。(小时)ChR2–315-E123Q在–100 mV、pH 7.6时的光电流
图3。
图3。
离体内外巨膜片中ChR2光电流的激活爪蟾卵母细胞。这种配置允许通过改变过量的镀液在细胞质侧快速改变浓度（≈100 ms；参考43）。(一)442 nm光脉冲激活内向光电流（灰色条）。使用的移液管溶液为115 mM NMG-Cl，pH 5；所使用的浴（细胞质溶液）是115mM NMG-Cl、pH 7。显示了其他九个实验中的典型电流。(b条)通过两次持续时间为10-ns（箭头）、440 nm的激光闪光激活光电流。使用的移液管溶液为115 mM NMG-Cl，pH 5；使用的镀液为115 mM NMG-Cl，pH我7或115 mM NMG-Cl，pH我4，如图所示。显示了其他三个实验中的典型电流。(c（c）)第一光电流的时间分辨率更高，如所示b条，pH值我= 7. (d日)闭合速率对pH值的依赖性我(n个= 4–7). (e（电子）)ChR2光循环的简单三态模型。光，弯曲箭头表示从ChR2-接地状态（C）到打开状态（O）的光激活步骤。直箭头表示暗反应，即闭合脱敏状态（D）和返回基态（C）。有关更多详细信息，请参阅正文。(（f）)用τ模拟光电流直流=2 s和其他时间常数，如e（电子）. (克)用τ模拟光电流直流=60 ms和其他时间常数，如e（电子）.
图4。
图4。
ChR2和ChR1的作用光谱C.莱因哈迪膜组分和ChR2诱导的膜去极化。(一)pH条件下ChR2介导的卵母细胞内向电流的归一化作用谱o（o）=7.6和–100 mV（□，n个=3）和来自C.莱因哈迪pH 9下的菌株CW2(▪).C.莱因哈迪细胞在弱光（0.5 W·m）下生长–2个)持续3天。用NMG-Hepes，2 mM Ca直接从眼点记录光电流2+，和2 mM K+在移液管（21）中。实线显示标准视紫红质光谱[Dartnall光谱（41）]，与数据点相匹配。卵母细胞中测得的ChR1光电流光谱（24）和C.莱因哈迪绘制pH值为7（21）时的曲线图以进行比较。(b条和c（c）)C.莱因哈迪细胞在黑暗（D）、低光条件（LL，0.5 W·m）下生长–2个)和强光条件（HL；10 W·m–2个). 收集膜组分并通过蛋白质免疫印迹分析。第1章310–546针对兔的Chop1–310-546片段制备抗血清（1:1000稀释）。(b条)它识别了Chop1和Chop2。(c（c）)第二章617–723抗血清（针对Chop2-617-723片段制备）对Chop2具有特异性。使用碱性磷酸酶偶联第二抗体检测结合。Chop1和Chop2片段表达于大肠杆菌（车道4、车道5、车道9和车道10）被吸墨以进行比较。(d日和e（电子）)如灰色条所示，蓝光使ChR2-表达细胞去极化。显示了其他四个实验中的典型电压。(d日)在林格溶液（110 mM NaCl/5 mM KCl/2 mM CaCl）中表达ChR2–315的卵母细胞2/1 mM氯化镁2pH值7.6）。(e（电子）)一种HEK293细胞，瞬时表达ChR2–315。使用的移液管溶液为140 mM KCl、5 mM EGTA、2 mM MgCl2，10 mM Hepes，pH 7.4。使用的镀液为140 mM NaCl，2 mM MgCl2，1 mM氯化钙2，10mM Hepes，pH 7.4。
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