A calcium-induced calcium influx factor, nitric oxide, modulates the refilling of calcium stores in astrocytes

doi:10.1523/JNEUROSCI.23-32-10302.2003

.2003年11月12日；23(32):10302-10.

doi:10.1523/JNEUROSCI.23-32-10302.2003。

钙诱导的钙内流因子一氧化氮调节星形胶质细胞钙储存的再充盈

李念珍¹, 南斋月, 菲利普·海登

附属公司

采购管理信息： 14614089
预防性维修识别码： PMC6741013型
DOI（操作界面）： 10.1523/JNEUROSCI.23-32-10302.2003

钙诱导的钙内流因子一氧化氮调节星形胶质细胞钙储存的再充盈

李念珍等。神经科学. 2003.

.2003年11月12日；23(32):10302-10.

doi:10.1523/JNEUROSCI.23-32-10302.2003。

作者

李念珍¹, 南斋月, 菲利普·海登

附属

¹爱荷华州立大学动物学和遗传学系，美国爱荷华州埃姆斯50011。

采购管理信息： 14614089
预防性维修识别码： PMC6741013型
DOI（操作界面）： 10.1523/JNEUROSCI.23-32-10302.2003

摘要

一氧化氮在星形胶质细胞中的作用尚未明确，星形胶质细胞是突触传递中的活跃伙伴。由于一氧化氮合酶存在于星形胶质细胞中，我们使用DAF-FM（4-氨基-5-甲氨基-2'，7'-二氟荧光素二乙酸酯）成像培养的小鼠皮层星形胶质细胞一氧化氮的形成。我们证明，生理浓度的ATP诱导Ca2+依赖性一氧化氮的产生。然后，我们通过外源性应用一氧化氮供体研究了一氧化氮在星形细胞Ca2+信号传导中的作用，发现一氧化氮诱导了外部Ca2+的内流。由于这些观察结果增加了一氧化氮依赖性Ca2+内流可能导致Ca2+重新填充内部存储的可能性，因此我们在操纵一氧化氮的同时直接监测了胞浆和内部存储的Ca2+水平。用mag-fluo-4和X-rhod-1对培养物进行涂布，以分别对内部储存物和胞浆进行不同负荷。ATP诱导细胞溶质中Ca2+的增加，这是由IP3依赖性地从内部存储释放Ca2+所致，检测到mag-fluo-4同时减少，X-rhod-1荧光增加。为了监测商店补货情况，我们测量了去除ATP后mag-fluo-4荧光的恢复。当一氧化氮清除剂2-苯基-4,4,5,5-酮甲基-咪唑啉-1-氧基-3-氧化物或一氧化氮合酶抑制剂NG-单甲基-l-精氨酸阻断一氧化氮信号传导时，荧光恢复显著降低。这些数据表明，在星形胶质细胞中诱导Ca2+信号传导的递质导致了Ca2+依赖性一氧化氮的合成。这反过来刺激了Ca2+流入途径，这在一定程度上负责重新填充内部Ca2+存储。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
ATP诱导星形胶质细胞产生一氧化氮。A类，装载一氧化氮敏感染料DAF-FM的纯化星形胶质细胞的荧光图像示例。B类，10μ的典型痕迹米在对照条件下（实线）和用一氧化氮合酶抑制剂处理后，ATP诱导DAF-FM荧光增强我-NMMA（300μ米30分钟；虚线）。数据点是一个实验中成像场中所有细胞的平均值。误差线为SEM。C，加利福尼亚州²⁺提升10μ米ATP与Ca成像²⁺指示剂fluo-3。中的数据C来自一个单独的实验，而不是B类并显示出细胞溶质钙变化的时间过程²⁺与一氧化氮生成有关。D类，汇总图显示一氧化氮清除剂PTIO显著降低了星形胶质细胞中ATP诱导的DAF-FM荧光增加的幅度(n个=171个细胞，4个实验）。首先用10μ米ATP 30秒，在生理盐水中清洗10分钟，在100μ水中清洗5分钟米PTIO，然后用PTIO中的ATP再次刺激。在生理盐水中洗涤15分钟后，用ATP第三次刺激细胞。E类、一氧化氮合酶抑制剂预处理我-NMMA（300μ米30分钟；n个=244个电池，4个实验），但不包括其非活动模拟d日-NMMA（300μ米30分钟；n个=197个细胞，4个实验），阻止了ATP诱导的DAF-FM荧光增加（未经处理的对照，n个=188个细胞，4个实验；注意，每个直方图都来自于在不同细胞上并行执行的单独实验）。使用学生的t吨测试时间：^*第页< 0.05,^**第页<0.01，以及^***第页< 0.001. 误差条表示SEM。

**图2。**
ATP诱导的一氧化氮生成是P₂受体介导和钙²⁺依赖。A类、P治疗₂受体拮抗剂PPADS（50μ米，5分钟）抑制Ca²⁺ATP引起的高度(n个＝195个细胞，4个实验）。B类，PPADS治疗显著降低ATP诱导的DAF-FM荧光增强幅度(n个=150个细胞，4个实验）。C，细胞与钙孵育后²⁺螯合剂BAPTA（BAPTA AM，30μ米，45分钟），ATP诱导的钙²⁺标高被阻挡(n个=BAPTA中的242个细胞和对照条件下的316个细胞，每个实验3次）。D类，用BAPTA处理（BAPTA AM在30μ米，45分钟）显著降低ATP诱导的DAF-FM荧光增加的幅度(n个=BAPTA中240个细胞，对照条件下174个细胞，每个实验4次）。使用学生的t吨测试时间：^*第页< 0.05,^**第页<0.01，以及^***第页< 0.001. 误差条表示SEM。

**图3。**
一氧化氮供体SNAP诱导外源性钙内流²⁺变成星形胶质细胞。A类，SNAP（100μ米)一氧化氮供体引起细胞DAF-FM荧光增强，证实SNAP在生理盐水中自发释放一氧化氮。B类，典型星形细胞钙²⁺增加对SNAP的响应。星形胶质细胞负载荧光钙²⁺指示剂fluo-3。用SNAP（100μ米，45秒）。轨迹是成像场中所有细胞的平均值(n个=31个单元格）。误差线为SEM。C，一氧化氮负责SNAP诱导的钙²⁺随着一氧化氮清除剂PTIO抑制SNAP引起的fluo-3荧光增强而增加。使用了三种应用协议。第一个和第三个SNAP应用程序被用作每个单元的内部控制(n个=114个细胞，3个实验）。D类，用生理盐水冲洗10分钟后，细胞如所示B类用zero-Ca治疗²⁺生理盐水30秒，并再次用SNAP刺激。这次，小卡²⁺这种变化是由SNAP引起的。E类，摘要直方图显示，第二个SNAP应用程序在zero-Ca中²⁺盐水诱导较小的星形细胞钙²⁺在生理盐水中比第一次（对照）和第三次（恢复）应用增加(n个=84个细胞，4个实验）。使用学生的t吨测试时间：^*第页< 0.05,^**第页<0.01，以及^***第页< 0.001. 误差条表示SEM。

**图4。**
外部Cd²⁺和2-APB阻断SNAP诱导的Ca²⁺星形胶质细胞升高，表明一氧化氮诱导钙²⁺通过仓库运营渠道涌入。A类，显示Cd的实验痕迹示例²⁺（非特异性钙²⁺通道阻滞剂；100 μ米)阻断SNAP诱导的钙²⁺流入。第一次和第三次SNAP应用是在生理盐水中进行的，而第二次SNAP使用是在镉的存在下进行的²⁺.B类，Cd影响的汇总直方图²⁺关于SNAP诱导的钙²⁺流入，流入(n个=205个细胞，3个实验）。C，2-APB（75μ米，10分钟），IP_三受体拮抗剂与电容性钙²⁺进入抑制剂，减少SNAP诱导的钙²⁺显著增加。使用了与中类似的协议*答：D*，2-APB对SNAP诱导Ca影响的柱状图²⁺流入(n个=96个细胞，3个实验）。使用学生的t吨测试时间：^*第页< 0.05,^**第页<0.01，以及^***第页< 0.001. 误差条表示SEM。

**图5。**
星形细胞Ca的同时监测²⁺通过与两个荧光钙结合，分别在细胞溶质和内部储存物中的水平²⁺指示器，X-rhod-1和mag-fluo-4。A类，一组含有mag-fluo-4和X-rhod-1的星形胶质细胞示例。首先在37°C下用mag-fluo-4（mag-fluo-4 AM，10μg/ml）加载细胞，然后在室温下用X-rhod-1（X-rhod-1AM，2.5μg/ml。X-Rhod-1和mag-fluo-4图像分别以红色和绿色显示；第三列显示了这两个通道的叠加。X-Rhod-1染色更均匀，而mag-fluo-4染色有明显的点状图案。这与X-rhod-1和mag-fluo-4分别加载到细胞溶质和内部储存室中一致。B类、Thapsigargin（1μ米)，不可逆ER-Ca²⁺-ATP酶抑制剂可增加细胞溶质钙²⁺通过耗尽ER内部Ca²⁺储存，导致mag-fluo-4荧光降低，同时X-rhod-1荧光增加。结果证实，我们同时监测了Ca的细胞溶质和内部储存（主要是ER）²⁺带有X-rhod-1和mag-fluo-4。C，ATP（20μ米)已知可诱导胞浆钙²⁺释放Ca升高²⁺从内质网存储中，导致mag-fluo-4荧光减少，X-rhod-1荧光双相增加，表明这两个荧光信号指示细胞内和胞内钙的存储²⁺分别为。D类，使用zero-Ca的实验²⁺含ATP的EGTA外盐水进一步验证了同时监测细胞溶质和内部钙储存的双指标方法²⁺。中的单元格C再次受到ATP刺激，但在零Ca存在的情况下²⁺EGTA，ATP诱导的mag-fluo-4荧光降低在去除ATP后无法恢复，直到Ca²⁺重新引入镀液中，X-rhod-1荧光的增加缺乏升高的平台相，这两者都与钙的消除作用相一致²⁺大量涌入。

**图6。**
ATP诱导钙释放²⁺从内部存储和后续存储重新填充。A类，一个示例实验表明，ATP（20μ米)细胞溶质钙的诱发增加²⁺钙释放的结果²⁺来自内部商店。这些图像是mag-fluo-4和X-rhod-1荧光的伪彩色图像，对应于图中标记的时间B类(一，ATP应用前30秒；b条，启动ATP后10秒；*c（c）*，启动ATP后40秒；d日，去除ATP后2分钟显示完全恢复）。注意，在ATP作用下，mag-fluo-4荧光降低，X-rhod-1荧光增加，但在去除ATP后2分钟，两个信号都恢复到其基本水平。B类，显示细胞mag-fluo-4和X-rhod-1荧光平均变化的痕迹A类.

**图7。**
抑制一氧化氮蓄积减少内部钙的再充盈²⁺商店。A类，显示ATP诱导的胞浆Ca升高的一个实验的痕迹示例²⁺和内部储存钙的消耗²⁺以及随后在经PTIO处理的细胞中进行存储再填充。注意，与控制条件（图6）不同，内部Ca²⁺在PTIO在场的情况下，商店只进行了部分加油。图中的水平线是人为绘制的线，用于指示mag-fluo-4的基线水平（b；应用ATP前3帧的平均值）、最大减少量（m）和恢复水平（r；去除ATP后2分钟前3帧平均值）*数据流*/F类₀Δ1和Δ2分别表示r和m以及b和m之间的差异。B类、内部存储Ca变化的时间过程²⁺在对照条件下和经PTIO处理的细胞中的水平，表明与对照条件相比，在存在PTIO的情况下，内部存储没有完全重新填充（平行进行的实验）。数据点代表每组所有实验中所有细胞的平均值。C，总直方图显示存储重新填充（Δ1/Δ2^*100）被NO清除剂PTIO减少(n个=9个实验），以及NOS抑制剂我-NMMA公司(n个=6个实验），但不通过其非活动模拟d日-NMMA公司(n个=7个实验）。使用学生的t吨测试时间：^*第页< 0.05,^**第页<0.01，以及^***第页< 0.001. 误差条表示SEM。

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