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.2003年11月；23(22):8070-83.
doi:10.1128/MCB.23.22.8070-8083.2003。

IkappaB激酶非依赖性IkappaBα降解途径：功能性NF-κB活性及其对癌症治疗的意义

维奈·特甘卡 1, 弗吉尼亚·波特罗, 池泽正彦, 李秋堂, Inder M Verma公司
附属公司

IkappaB激酶依赖的Ikappa Balpha降解途径：功能性NF-kappaB-活性及其在癌症治疗中的意义

维奈·特甘卡等。 分子细胞生物学. 2003年11月.

摘要

NF-kappaB在肿瘤中的抗凋亡活性有助于获得化疗耐药性。IkapaB的降解是NF-kappaB活化的重要步骤。IkappaB激酶IKK1和IKK2参与了Ikappa B的降解和NFkappa的后续修饰。使用缺乏IKK1和IKK2基因（IKK1/2（-/-））的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），我们记录了一种新的IkappaB降解机制。我们表明，化疗药物阿霉素（DoxR）诱导的这种降解不需要经典的丝氨酸32和36磷酸化或IkappaBalpha的PEST结构域。IkappaBalpha的降解部分被磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂LY294002阻断，并由蛋白酶体介导。DoxR诱导IkappaB在IKK1/2（-/-）细胞中降解产生的游离NF-kappaB-能够激活基于染色质的NF-kapbaB报告基因和内源性靶基因Ikappa Balpha的表达。这些结果还表明，在从IkappaB释放NF-kappaB-之前或之后，通过IKK1或IKK2修饰NF-kapbaB对NF-kampaB-介导的基因表达并不重要，至少对DNA损伤是如此。此外，通过阻断蛋白酶体活性，同时抑制NF-kappaB活化，可以增强DoxR诱导的IKK1/2（-/-）MEF细胞死亡。这些结果揭示了在抗癌治疗过程中激活NF-kappaB的额外途径，并为蛋白酶体抑制剂可作为化疗佐剂的观察提供了机制基础。

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数字

图1。
图1。
DoxR诱导IKK1/2中IκBα降解−/−MEF公司。（A） IKK1/2型−/−MEF被镀在六孔板中，并允许到达汇流处。用指定剂量的DoxR处理细胞，24小时后进行Western blot。（B） 利用NIH图像软件进行IκBα降解的密度定量。IκBα与肌动蛋白的比值已绘制在年轴。（C） 用TNF-α或LPS处理生长在六孔培养皿中的汇合细胞，处理时间为指定的时间。制备全细胞裂解物，并用所示抗体进行Western blot分析。
图2。
图2。
DoxR诱导IKK1/2中IκBα降解的时间进程−/−MEF公司。（A） 合流IKK1/2−/−MEFs用0.7μg DoxR/ml处理指定的时间（以小时为单位），并用指定的抗体进行蛋白质印迹。非特异性蛋白质（NS）的水平用星号表示。（B） DoxR缺乏或存在时IκBα水平的脉冲相分析。IKK1/2型−/−MEF挨饿，随后贴上标签35S蛋白标记混合物（NEN）。在指定的持续时间内，使用或不使用0.7μg DoxR/ml进行Chase。非特异性（NS）蛋白质的水平显示为负荷控制。
图3。
图3。
DoxR引起的IκBα降解不需要丝氨酸32和36以及PEST结构域中的磷酸化。（A） IKK1/2−/−MEF感染pLXSH或pLXSH-IκBαM逆转录病毒，并使用潮霉素进行稳定筛选。IKK1/2混合种群−/−Hygro（1-6车道）和IKK1/2−/−IκBαM细胞（7至12道）感染rAD，表达GFP（rAD-GFP）、IK2WT（rAD-IKK2WT）或IK2KM（rAD-IKK2m）。感染后48小时，细胞未经处理或用0.4μg DoxR/ml处理。分别用Flag M2和IκBα（C21）抗体测定IKK2和Iκ）Bα蛋白的表达。肌动蛋白水平用于蛋白质负荷的正常化。（B） IκBα−/−MEF感染了表达IκBα，IκBαM的显性负性形式的逆转录病毒。如前所述，生成稳定的细胞池，并将其置于六孔培养皿中。用0.5和0.7μg DoxR/ml处理融合细胞24 h。用C21抗体探测裂解液以检测IκBαM。
图4。
图4。
DoxR引起的IκBα降解不需要PEST结构域。（A） IKK1/2型−/−MEF被表达IκBαΔ39的逆转录病毒感染，该逆转录病毒缺乏IκB-α的最后39个氨基酸。用潮霉素筛选细胞，用指定剂量的DoxR处理混合池细胞24 h，并用IκBαC15抗体检测IκBα降解。（B） IKK1/2中IκBαΔ39降解的时间进程−/−MEF公司。用0.5μg DoxR/ml处理融合细胞，持续时间为小时，并用IκBαC15抗体进行IκAαΔ39的Western blot分析。（C） IκBα−/−MEF感染了表达GFP（作为对照）或表达IκBαΔ39的逆转录病毒。如前所述，生成稳定的细胞池，并将其置于六孔培养皿中。将融合细胞用0.5和0.7μg DoxR/ml处理24 h。用C15抗体探测裂解液以检测IκBαΔ39。
图5：。
图5：。
DoxR对IκBα的降解不通过ROS、p53或半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶介导。（A） 合流IKK1/2−/−如图所示，用0.7μg DoxR/ml和10 mM NAA或NAC处理MEF。24小时后，对细胞进行裂解，并进行蛋白质印迹。（B） IKK1/2型−/−在六孔培养皿中培养MEFs，并在300μl含有5%胎牛血清和抗生素的DMEM中用rAD-p53或rAD-GFP的MOI增加感染。每10分钟摇晃一次平板，让感染继续进行2小时，然后用培养基补充细胞，但不清除病毒。在37°C下与新鲜培养基孵育过夜后，更换该培养基。在感染后48至60小时内，通过Western blot分析对细胞进行裂解和分析。（C） IKK1/2型−/−如图所示，MEF单独使用DoxR或与各种caspase抑制剂联合治疗24小时，然后通过Western blotting进行分析。行：Casp 1、caspase-1抑制剂VI、Z-YVAD-FMK；Casp-2、caspase-2抑制剂I、Z-VDVAD-FMK；casp3，caspase-3抑制剂II，Z-DEVD-FMK；Casp 5，caspase-5抑制剂I，Z-WEHD-FMK；Casp 6，caspase-6抑制剂I，Z-VEID-FMK；Casp 8，caspase-8抑制剂II，Z-IETD-FMK；Casp 9，caspase-9抑制剂I，Z-LEHD-FMK。所有这些都是各种半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的细胞可渗透、不可逆的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，如其数量所示。Caspase抑制剂III（Casp Ihn III），Boc-d日-FMK是一种广谱半胱天冬酶抑制剂。有关这些抑制剂的更多信息，请参阅钙生物化学信息表。
图6。
图6。
其他激酶在DoxR介导的IκBα降解中的作用。（A） IKK1/2型−/−用0.7μg DoxR/ml单独或与LY294002（80μM）联合治疗MEF。24小时后进行Western blot分析。肌动蛋白和一种非特异性（NS）蛋白的水平被用作负载对照。（B） IKK1/2型−/−用0.7μg DoxR/ml和蛋白酶体抑制剂乳酸菌素（20μM）处理MEF 10 h。对处理和未处理的细胞进行裂解，并免疫沉淀IκBα。免疫沉淀物质与指示的磷酸特异性抗体通过Western blot进行分析。用C21抗体分析总IκBα水平。
图7。
图7。
NF-κB活性对DoxR的反应。（A） IKK1/2型−/−使用指定剂量的DoxR治疗MEF 12 h，并使用NF-κB共识寡核苷酸（左面板）或Oct-1寡核苷酸（中面板）分析凝胶转移活性。使用p50、p65和p52抗体对来自用0.7μg DoxR/ml处理过的细胞的提取物进行超移分析（右侧面板）。（B） 构建LV-κ-Bluc和LV-Mut-κ-Bluc载体。κB结合位点的位置以及TATA盒都已显示。（C） IKK1/2型−/−用LV-κBLuc转导MEF，并用DoxR（0.3μg/ml）、TNF-α（10 ng/ml）和LPS（30 ng/ml）处理这些细胞池18 h。荧光素酶活性在96周平板阅读器中进行评估。（D） IKK1/2型−/−MEF用LV-κBLuc或LV-Mut-κBLuc载体转导，这些细胞池用DoxR处理18小时，然后测量荧光素酶活性。（E） IκBα的实时PCR分析。IKK1/2型−/−用指定剂量的DoxR处理MEF，并通过实时PCR分析测定IκBα和肌动蛋白信息的水平。对IκBα水平与肌动蛋白水平的比值进行了量化，并在年轴。
图8。
图8。
DoxR诱导的NF-κB活性的功能相关性。（A） DoxR介导的IκBα降解需要蛋白酶体。IKK1/2型−/−MEF用二甲基亚砜、乳酸菌素（20μM）或0.7μg DoxR/ml单独或联合治疗，如图所示。处理24小时后制备裂解物，并按照前面所述进行Western blot分析。（B） IKK1/2型−/−MEF分别用DoxR（0.7μg/ml）、lactacystin（20μM）或这两种药物的联合治疗。24小时后观察细胞。分离的和凋亡的细胞比附着的细胞更难折射。（C） DoxR和lactacystin诱导的细胞死亡定量。用台盼蓝活性测定法测定处理24至30小时后附着和分离细胞的细胞存活率。该图代表了三种独立分析。
图9：。
图9：。
（A） 在缺乏IKK活性的情况下，游离p65可以防止TNF-α诱导的细胞凋亡。IKK1/2型−/−用LV-GFP或LV-GFP-p65转导的MEFs在转导后48小时用TNF-α处理。TNF-α处理48小时后，用结晶紫染色细胞以评估细胞存活率。（B） GFP-p65的亚细胞定位。带电IKK1/2−/−用反褶积显微镜在×60倍放大下对LV-GFP或LV-GFP-p65转导的细胞进行成像。（C） 模型基于我们的研究。TNF-α和白细胞介素-1等细胞因子主要利用IKK2，淋巴毒素β（LTβ）和RANK配体（RANKL）利用IKK1激活NF-κB。与这些刺激不同，DoxR可以以IKK1和IKK2依赖的方式激活NF-κB。尽管起源不同，NF-κB激活的所有途径都被蛋白酶体抑制剂阻断。根据本报告中的数据，TNF-α信号转导（A）或DoxR诱导（图7C和E）后产生的p65/p50复合物（以红色显示）的功能激活不需要IKK1或IKK2进一步修改。
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