Reverse genetics with a full-length infectious cDNA of severe acute respiratory syndrome coronavirus

doi:10.1073/pnas.1735582100

.2003年10月28日；100(22):12995-3000.

doi:10.1073/pnas.1735582100。 Epub 2003年10月20日。

严重急性呼吸综合征冠状病毒感染性全长cDNA的反向遗传学研究

博伊德·扬特¹, 克里斯托弗·M·柯蒂斯, 伊丽莎白·A·弗里茨, 丽莎·汉斯莱, 彼得·贾林, 埃里克·普伦蒂斯, 马克·丹尼森, 托马斯·盖斯伯特, 拉尔夫·巴里奇

附属公司

PMID： 14569023
预防性维修识别码： PMC240733型
内政部： 10.1073/pnas.1735582100

重症急性呼吸综合征冠状病毒全长感染性cDNA的反向遗传学研究

博伊德·扬特等。美国国家科学院程序. 2003.

.2003年10月28日；100(22):12995-3000.

doi:10.1073/pnas.1735582100。 Epub 2003年10月20日。

作者

博伊德·尤恩特¹, 克里斯托弗·柯蒂斯, 伊丽莎白·A·弗里茨, 丽莎·汉斯莱, 彼得·贾林, 埃里克·普伦蒂斯, 马克·丹尼森, 托马斯·盖斯伯特, 拉尔夫·巴里奇

附属

¹北卡罗来纳大学流行病学和微生物学系，北卡罗来那州教堂山，北卡罗莱纳州27599-7435，美国。

PMID： 14569023
预防性维修识别码： PMC240733型
内政部： 10.1073/pnas.1735582100

摘要

先前未描述的冠状病毒（CoV）是导致严重急性呼吸综合征（SARS）的病原体。使用一组跨越整个基因组的连续cDNA，我们组装了SARS-CoV Urbani株的全长cDNA，并拯救了分子克隆的SARS病毒（传染性克隆SARS-CoV），其中包含插入到组成克隆中的预期标记突变。重组病毒的复制效率与WT病毒一样高，两者均被半胱氨酸蛋白酶抑制剂（2S，3S）-转环氧琥珀酰基-L-亮氨酸氨基-3-甲基丁烷乙酯抑制。此外，在野生型和传染性克隆严重急性呼吸系统综合征冠状病毒中，亚基因组转录物都是从共有序列ACGAAC启动的。SARS-CoV全长cDNA的可用性为操纵病毒基因组提供了一个模板，从而能够快速合理地开发和测试针对这一重要人类病原体的候选疫苗和治疗药物。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
全长SARS-CoV cDNA的组装。(A类)SARS-CoV基因组的结构（8，9）。SARS Urbani≈29727-bp基因组包含10个或更多ORF，它们由全长和亚基因组mRNA表达（8）。(B)几个*Bgl公司*组件克隆之间插入I-互连连接，以组装全长cDNA。小写字母代表WT序列，数字代表基因组中的核苷酸位置。(C类)“不见了”阿尔我修复SARS同胞克隆。星号代表突变位点。粗体数字代表组成一致的SARS F亚克隆的兄弟克隆的部分。

**图2。**
SARS-CoV全长转录本具有传染性。在存在或不存在SARS N转录物的情况下，将全长转录物电穿孔到BHK细胞中，并覆盖敏感的VeroE6细胞。通过荧光Ab染色检测部分细胞。(A类)用SARS-CoV全长转录物转染的培养物。(B)SARS全长转录本加N转录本。(C类)未感染对照。(天)通过菌斑试验测定转染后最初96 h的病毒生长；仅icSARS转录本(▪) 和icSARS加N转录本，试验1（⋄）和试验2(▵). (E类)Vero E6细胞中的icSARS-CoV和WT SARS-CoV斑块。

**图3。**
icSARS-CoV标记突变。跨不同区域的cDNABgl公司从WT和icSARS-CoV感染的细胞中扩增I连接。对片段进行纯化，并用*Bgl公司*并在1.2%琼脂糖凝胶中分离。(A类)icSARS-CoV（车道2、3、6、7、10和11）和WT SARS-CoV（车道4、5、8、9、12和13）。通道2–5，一个1668-nt扩增子（核苷酸位置1007–2675），用*Bgl公司*I（3号和5号车道）；车道6–9，一个跨越SARS-CoV B/C交界处（位置8381–9180）的799-nt扩增子*Bgl公司*I（7号和9号车道）；车道10–13，一个544-nt扩增子（位置11721–12265），跨越SARS-CoV C/D交界处*Bgl公司*I（11和13车道）。车道1和14，一个1kb的梯子。(B)WT SARS（4、5、8和9车道）；icSARS-CoV（车道2、3、6和7）。2–5车道，一个652-nt扩增子，跨越SARS-CoV D/E交界处，经消化*Bgl公司*I（3号和5号车道）；车道6–9，一个1594-nt扩增子（位置23665–25259），跨越SARS-CoV E/F交界处*Bgl公司*I（7号和9号车道）。车道1和10，一个1kb的梯子。(C类)对1594-nt SARS E/F连接区的扩增子进行亚克隆和测序，证明了在icSARS-CoV中引入的突变。

**图4。**
WT和icSARS-CoV的表型比较。用0.1的多重感染感染感染细胞培养物。1小时后，用浓度为500μg/ml的E64-d处理培养物，并通过菌斑试验测定VeroE6细胞中的病毒滴度(C类). (A类)Urbani的增长(▪), icSARS(□), 和Tor-2(▴) 和Tor-7(▵) CoV。(B)编码各种icSARS-CoV亚基因组ORF的含铅转录本。*，使用标准CoV命名法分类的预测ORF（11）。(C类)在存在或不存在E64-d的情况下，icSARS和Urbani SARS-CoV的生长。孵化棒，24小时滴度；黑条，48小时滴度。(天)感染后72小时，Urbani SARS-CoV感染细胞。

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