Transcriptional activation via sequential histone H2B ubiquitylation and deubiquitylation, mediated by SAGA-associated Ubp8

doi:10.1101/gad.1144003

.2003年11月1日；17(21):2648-63.

doi:10.1101/gad.1144003。 Epub 2003年10月16日。

通过SAGA相关的Ubp8介导的顺序组蛋白H2B泛素化和去泛素化的转录激活

卡尔·W·亨利¹, 阿纳斯塔西娅·怀斯, 罗万胜, 劳拉·J·达根, N C托尔加·埃姆雷, 成福高, 洛兰·皮卢斯, 阿里·希拉蒂法德, 玛丽·安·奥斯利, Shelley L Berger女士

附属机构

PMID： 14563679
预防性维修识别码：项目经理280615
DOI（操作界面）： 10.1101/gad.1144003

SAGA相关Ubp8介导的组蛋白H2B泛素化和氘化的转录激活

卡尔·W·亨利等人。基因开发. 2003.

.2003年11月1日；17(21):2648-63.

doi:10.1101/gad.1144003。 Epub 2003年10月16日。

作者

卡尔·W·亨利¹, 阿纳斯塔西娅·怀斯, 罗万胜, 劳拉·J·达根, N C托尔加·埃姆雷, 成福高, 洛兰·皮卢斯, 阿里·希拉蒂法德, 玛丽·安·奥斯利, 雪莱·L·伯杰

附属

¹威斯塔研究所，美国宾夕法尼亚州费城，19104。

PMID： 14563679
预防性维修识别码：项目经理280615
DOI（操作界面）： 10.1101/gad.1144003

摘要

乙酰化和去乙酰化调节的基因激活和抑制是组蛋白修饰功能的范例。我们提供的证据表明，相比之下，组蛋白H2B单泛素化及其去泛素化都参与了基因激活。取代Lys 123（K123）的H2B泛素化位点降低了乙酰化复合物SAGA调节的某些基因的转录。基因相关的H2B泛素化是短暂的，在激活的早期增加，然后随着RNA的大量积累而减少。我们表明，体外SAGA介导组蛋白H2B的氘化反应需要Ubp8，它是SAGA乙酰化复合物的一种成分。体内Ubp8的丢失增加了泛素化H2B的基因相关和整体细胞水平。Ubp8的缺失降低了SAGA调节基因的转录，SAGA内Gcn5乙酰转移酶的代码缺失加剧了这种缺陷的严重性。此外，H2B泛素化或Ubp8-介导的氘化的破坏导致基因相关的H3 Lys 4甲基化和Lys 36甲基化水平的改变，这两者都与转录有关。这些结果表明组蛋白H2B泛素化状态在转录过程中是动态的，组蛋白修饰序列有助于控制转录。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
泛素化H2B在SAGA依赖基因表达中的作用。(A类)*镀锌1*和*抽吸2*转录*HTB1型*和*htb1-韩国*细胞。用S1核酸酶保护试验分析RNA。折叠诱导计算为诱导条件（I）下与抑制条件（R）下的表达水平，并表示为野生型诱导的百分比（设置为100%）。tRNA被用作基因特异性RNA的负荷控制。抑制和诱导条件分别为，*镀锌1*，2%葡萄糖和2%半乳糖在OD下持续2.5小时_600纳米= 0.8;*SUC2公司*OD时，2%葡萄糖和0.05%葡萄糖持续2.5小时_600纳米< 0.5. 菌株为野生型(*HTB1型*⁺)和*htb1-韩国*，在已知H2B泛素化位点的残基123处发生赖氨酸-精氨酸取代（Robzyk等人，2000年）。通过荧光成像仪分析进行定量。(B类)半乳糖诱导期间ubH2B的双染色质免疫沉淀（ChDIP）和RNA分析。直方图表示ChDIP分析，线形图表示RNA分析。甲醛交联染色质是从野生型(左边)和*htb1-韩国*(*正确的*)在葡萄糖培养基（Glu）中或在含半乳糖培养基中的指定时间段内携带标记H2B和HA的泛素的菌株。首先用抗标记抗体（M2，Sigma）免疫沉淀超声染色质，然后用3×标记肽（Sigma，Flag）洗脱。洗脱液在洗脱前用抗HA抗体（12CA5，Roche）进行免疫沉淀。实时对洗脱的DNA进行定量PCR分析。来自*镀锌1*启动子（白色条）和Int.V区（黑色条）显示为相对免疫沉淀，即免疫沉淀物质与输入染色质的比率(*左侧Y*-轴）。*镀锌1*在相同的样品中检测RNA水平。从野生型中分离出RNA(左边)或*htb1-韩国*(*正确的*)样品进行S1分析。*镀锌1*表达被归一化为tRNA水平，表现为表达相对于葡萄糖表达的倍数变化(*右侧Y*-轴）。(C类)ubH2B ChDIP和*镀锌1*野生型细胞在去表达和激活过程中的RNA分析。治疗方法与B类除了细胞在棉子糖中培养(*镀锌1*脱脂）2小时后再添加半乳糖。在葡萄糖中取样，然后在指定时间在棉子糖和半乳糖中取样。将数据归一化为输入和Int.V水平，并以相对IP的倍数表示，葡萄糖输入正常免疫沉淀值设置为1.0，所有其他值与这些样本进行比较。RNA被视为B类.

**图2。**
含Ada2配合物中Ubp8结合分析。(A类)全细胞提取物中Ubp8的色谱分离。含有Ada2-TAP和Ubp8-Flag的细胞提取物首先通过TAP纯化方法进行分离（Puig等人，2001年），然后通过MonoQ离子交换色谱法进行分离。对MonoQ柱中的平均数部分（14-42）进行Western blotting检测Ubp8-Flag，并与ADA/SALSA/SAGA相关（如图所示）Ada3和Gcn5、SALSA/SAGA相关Spt3和SAGA特异性Spt8进行比较。包括用于钙调素珠结合（C）和MonoQ柱（M）纯化步骤的输入（IN）和流通（FT）样品。(B类)ADA或SAGA复合物中Ubp8的结合。从MonoQ柱洗脱的ADA和SAGA组分用抗标记亲和树脂（Sigma）免疫沉淀，并进行SDS-PAGE和Western blotting检测Ubp8-Flag、Ada3和Gcn5。输入代表免疫沉淀中30%的物质。(C类)Gcn5和Ubp8的ChIP分析*镀锌1*发起人。ChIP分析了野生型背景中的Gcn5-3HA（开放条）和Ubp8-3HA（封闭条）结合*镀锌1*葡萄糖（0个时间点）和半乳糖（60和120分钟时间点）中的启动子。将这种关联与Int.V区[Gcn5-3HA样本（开条，黑条）或Ubp8-3HA（闭条，白条）]进行比较。数据以相对IP的倍数表示，葡萄糖输入正常免疫沉淀值设置为1.0，所有其他值与这些样本进行比较。

**图3。**
H2B泛素化*UBP8（UBP8）*和*ubp8*Δ应变。(A类)野生型和*ubp8*Δ应变。通过Western blot分析评估野生型和指示突变株中N-末端标记H2B的抗-Flag免疫沉淀物，以确定泛素修饰和未修饰Flag-H2B的相对水平，如前所述（Robzyk等人，2000年）。表3列出了用于Western blot分析的抗体。用抗Flag抗体和抗泛素抗体在单独的Western blot中检测ub-Flag-H2B，它们的迁移与分子量标准所示的相似（以千道尔顿为单位）。(B类)H2B的泛素化*放射性6*Δ,*标准贯入时间20*Δ和*ubp3基因*Δ应变。Western blotting按A类用指示菌株的抗旗帜免疫沉淀裂解物。指出了分子量标准的位置。(C类)SAGA内Ubp8对ubH2B的体外氘化作用。SAGA纯化自*UBP8（UBP8）*和*ubp8*Δ菌株和当量（见图5B）与ubH2B和H2B孵育30分钟，如图所示，ubH2B和H2B带有单标签或双标签。ubH2B和H2B通过抗标记免疫沉淀法从*ubp8*Δ细胞裂解物。输入是模拟处理的ubH2B样本。Western blotting用反Flag进行(左边; 检测含有标记和未标记泛素的H2B和ubH2B）或抗HA(*正确的*; 检测泛素修饰的H2B和游离泛素）。(下部面板，*正确的*)由SAGA从ubH2B水解的完整HA-ubquitin（根据分子量标准判断）*UBP8（UBP8）*样品，但不是来自SAGAubp8Δ. (D类)ubH2B的ChDIP分析*镀锌1*启动子*ubp8*Δ. 数据表示野生型（开盒、实线）和*ubp8*Δ（闭合框，虚线）背景，如图1C所示。

**图5。**
Ubp8缺失对SAGA功能和Gal4稳定性的影响。(A类)SAGA在野生型和*ubp8*Δ应变。(左侧)从Ubp8双标记（WT）或缺失的Ada2-TAP标记菌株中获得的IgG免疫沉淀样品的免疫印迹(*ubp8*Δ). 每次免疫沉淀均使用等量的蛋白质。(对)SAGA通过标准TAP程序纯化，然后使用MonoQ离子交换色谱法（如图2A所示）。野生型和*ubp8*Δ菌株通过蛋白质印迹法分析，使用每种纯化的SAGA复合物的两份连续稀释的样品。(B类)SAGA的HAT活性来源于野生型或*ubp8*Δ应变。等量野生型（白色条）的三倍连续稀释或*ubp8*如前所述，对Δ（灰条）SAGA复合物进行核心组蛋白（Sigma）的HAT活性分析（John等人，2000年）。背景（黑色条）表示包含^三不添加SAGA复合物的H-乙酸盐。(C类)Gal4在野生型和*ubp8*Δ应变。Gal4激活剂在野生型或*ubp8*Δ背景。用抗HA抗体免疫沉淀葡萄糖（0分钟）或半乳糖诱导培养物（30、60和90分钟）中收集的裂解物中的等量蛋白质，并用抗Gal4 DNA结合域抗体进行蛋白质印迹分析（表3）。

**图4。**
Ubp8在SAGA依赖性表达中的作用。(A类)细胞生长和表达*ubp8*Δ. (上部面板）在含有葡萄糖（YPD）、半乳糖（YP-半乳糖；*镀锌1*-诱导）或乙醇/甘油（YP-EtOH/Gly；*ADH2公司*-诱导）。将野生型或指示突变菌株接种并在30°C下培养48小时(下部在半乳糖培养期间，从指定时间收集的细胞颗粒中提取RNA（诱导*镀锌1*)或乙醇/甘油（诱导*ADH2型*)在指示菌株中。通过实时RT-PCR分析表达，并将其归一化为*行动1*水平。数据显示为折叠诱导，在葡萄糖培养基中野生型表达设置为1.0。(B类)遗传相互作用*ubp8*Δ特定于*通用条款5*Δ和否*安全气囊3*Δ。所示菌株的五倍系列稀释液按A类. (C类)Ubp8催化突变体分析。这个*ubp8*Δ*通用条款5*Δ突变体用含有*GCN5号机组*（启动子和开放阅读框架；pGCN5号机组)或者是野生型*UBP8（UBP8）*基因（pUBP8（UBP8）)或在Ubp8的假定催化位点发生替代突变的等位基因（pubp8^C146S型). 野生型和*ubp8*Δ*通用条款5*Δ也仅用载体进行转换。如图所示，将指数生长细胞的五倍系列稀释液置于选择性平板上，并在30°C下生长48小时。

**图6。**
组蛋白H2B泛素化改变对组蛋白H3甲基化状态的影响。(A类)H3 K4甲基化分析*htb1-韩国*或*ubp8*Δ应变。ChIP分析*镀锌1*野生型和*ubp8型*Δ应变。组蛋白H3 K4（3Me，顶部; 两百万，*中间的*; 和1Me，底部). 样本取自野生型（露天酒吧），*ubp8*Δ（灰色条），以及*htb1-韩国*（黑条）菌株在葡萄糖（Glu）中生长，并在转移到半乳糖培养基后指定的时间生长。数据表示免疫沉淀物质归一化为输入物质的扩增产物，并与野生型葡萄糖IP水平（设为1.0）进行比较。(B类)K36的组蛋白H3甲基化。用于A类使用H3 K36抗体进行二甲基化，如A类. The上面的面板显示野生型和*ubp8*Δ; 这个降低面板显示野生型和*htb1 KR公司*细胞在含有葡萄糖的培养基（Glu）中生长，清洗，并在添加半乳糖（Gal）之前转移到棉子糖培养基中2小时。

**图7。**
泛素化和氘化在*镀锌1*。的示意图*镀锌1*平衡状态下ORF TATA/5′端的启动子和核小体(A类; Ub+K4Me）并激活(B类; K4Me+K36Me）条件，显示野生型菌株中泛素化/氘化和甲基化之间的关系。Paf1复数同时加载Set1（K4Me）和Set2（K36Me）。这个降低漫画表现了泛素化和甲基化在*ubp8*Δ和*htb1-韩国*背景。(C类)在没有H2B泛素化的情况下，没有K4甲基化和高K36甲基化。(D类)在没有Ubp8的情况下，存在高K4甲基化和低K36甲基化。这些改变的泛素化/甲基化模式导致低转录。

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