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。2003年10月；23(20):7315-28.
doi:10.1128/MCB.23.20.7315-7328.2003。

Akt导向的葡萄糖代谢可防止Bax构象改变并促进生长因子依赖性生存

杰弗里·拉思梅尔 1, 凯西·J·福克斯, 大卫·R·普拉斯, 彼得·汉默曼, 瑞安·M·西纳利, 克雷格·B·汤普森
附属公司

Akt导向的葡萄糖代谢可防止Bax构象变化，促进生长因子非依赖性生存

杰弗里·拉思梅尔等人。 分子细胞生物学。 2003年10月。

摘要

丝氨酸/苏氨酸激酶Akt是许多受体信号转导途径的组成部分，可以防止生长因子退出后的细胞死亡。在这里，我们表明Akt对细胞死亡的抑制并不依赖于新的蛋白质翻译。相反，Akt抑制细胞死亡需要通过糖酵解来水解葡萄糖。研究发现，Akt通过转录后机制调节糖酵解的多个步骤，包括葡萄糖转运蛋白谷氨酸1定位到细胞表面以及在缺乏外源性因子的情况下维持己糖激酶功能。为了测试葡萄糖摄取和磷酸化在生长因子依赖性生存中的作用，用谷氨酸1和己糖激酶1（谷氨酸1/HK1）细胞转染细胞。谷蛋白1/HK1细胞在细胞表面积累谷蛋白1，具有与组成活性Akt（mAkt）细胞相似的高糖摄取能力。然而，与mAkt表达细胞不同的是，它们不消耗更多的葡萄糖，不维持延长的磷酸果糖激酶-1蛋白水平和活性，并且在缺乏生长因子的情况下不维持磷酸戊糖穿梭活性。然而，与对照细胞相比，在退出生长因子后，谷氨酸1和HK1的表达促进了细胞溶质NADH和NADPH水平的增加，阻止了Bax的激活，并促进了生长因子依赖性生存。这些数据表明Bax构象对葡萄糖代谢敏感，在缺乏生长因子的情况下，维持葡萄糖摄取和磷酸化可以促进细胞存活。此外，Akt需要葡萄糖和进行糖酵解以防止Bax活化的能力。因此，通过葡萄糖代谢的转录后调节防止Bax活化可能是Akt在缺乏生长因子的情况下维持长期细胞生存能力的一个必要方面。

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数字

图1。
图1。
Akt不需要蛋白质合成来促进生长因子衍生细胞的存活。对照组（Neo）和肉豆蔻酰化Akt（mAkt）表达细胞在无抑制剂的培养基或含有PI3-K抑制剂LY或蛋白翻译抑制剂CHX的培养基中从IL-3中提取。在第2天补充抑制剂。用LY处理细胞导致mAkt在第2天去磷酸化和失活，而在没有IL-3的情况下，mAkt保持磷酸化（数据未显示）。通过流式细胞术分析培养细胞在不同时间点的活性，通过PI排除法测定活性。所示值是三份样品结果的平均值；误差线表示标准偏差。
图2。
图2。
Akt需要一种可水解的葡萄糖底物，以防止在提取生长因子时死亡。对照组（Neo）（A）和mAkt转染的IL-3依赖性FL5.12（B）细胞在没有葡萄糖或存在10 mM葡萄糖或10 mM 2-DOG（一种不能通过糖酵解代谢的葡萄糖类似物）的情况下从IL-3中取出。在不同的时间点，通过流式细胞术分析细胞，通过碘化丙啶排除法测定细胞活力。（C） 在没有IL-3的情况下，在10小时后测量Neo和mAkt细胞的糖酵解率。所示值是三份样品结果的平均值；误差线表示标准偏差。
图3。
图3。
组成活性Akt促进葡萄糖摄取不是通过调节谷氨酸1蛋白水平，而是通过促进谷氨酸1细胞表面定位。（A） 对照组（Neo）和mAkt表达的IL-3依赖细胞在有IL-3或无IL-3的情况下培养5或10小时。然后采集细胞，测量其摄取不可水解葡萄糖类似物2-DOG的能力。所示值是三份样品结果的平均值；误差线表示标准偏差。（B） 通过Western blot分析对照细胞和mAkt细胞在存在IL-3或退出IL-3 10 h后葡萄糖转运蛋白谷氨酸1的表达。每条通道都装载了10μg蛋白质。（C） 对照（Neo）和mAkt细胞在有IL-3的情况下和无IL-3的10小时后通过免疫荧光染色进行谷氨酸1定位。每个显微照片都进行了单独的对比，以实现谷氨酸1定位的最佳可视化。条形代表5μm。（D） 在有IL-3存在的情况下或在没有IL-3的情况下12小时后，从对照细胞和mAkt表达细胞中分离出质膜，并通过Western blot分析10μg蛋白质的细胞表面谷氨酸1的表达。
图4。
图4。
谷氨酸1表达促进谷氨酸1表面定位的积累。（A和B）对照组和mAkt表达的FL5.12细胞与转染谷氨酸1、HK1或谷氨酸1和HK1的细胞（谷氨酸1/HK1）比较谷氨酸1表达（A）和HK1表达（B）。（C） 通过谷氨酸蛋白渗透细胞的免疫荧光染色，在对照、mAkt和谷氨酸1细胞中测定谷氨酸1定位。每个显微照片都进行了单独的对比，以实现谷氨酸1定位的最佳可视化。谷氨酸过度表达细胞的表面谷氨酸1免疫荧光足够明亮，对比图像后细胞内谷氨酸1变得模糊（数据未显示）。条形代表5μm。
图5：。
图5：。
组成活性mAkt细胞增强了其在退出IL-3后保持的己糖激酶活性。（A） 对照组（Neo）和mAkt细胞在IL-3中生长或从IL-3中提取12小时。分析整个细胞裂解物的己糖激酶总活性。（B） 在有IL-3存在的情况下或在没有IL-3的情况下12小时后，从对照细胞和mAkt细胞中分离出线粒体，并分析10μg蛋白质的己糖激酶活性。所示值是三份样品结果的平均值；误差线表示标准偏差。
图6。
图6。
组成活性Akt增加细胞总葡萄糖消耗。对照（Neo）、Glut1、HK1、Glut1/HK1和mAkt细胞在IL-3存在下培养，并每天观察5天。（A） 通过测量细胞浓度来测定细胞增殖。葡萄糖消耗量（B）和乳酸产生量（C）通过测量培养基中的浓度来确定。所示值是三份培养物结果的平均值；误差线表示标准偏差。
图7。
图7。
Akt可防止生长因子退出后PFK1蛋白水平和活性的损失。对照组（Neo）、谷氨酸1/HK1和mAkt细胞在有IL-3的情况下生长，或在无IL-3的条件下生长12小时。（A） 分离RNA，通过northern杂交检测PFK1的表达。（B） 用Western blot分析全细胞裂解产物中PFK1蛋白的表达。纯化的兔肌肉PFK1显示为尺寸标准。（C） 对细胞裂解物进行PFK1活性测试。所示值是三份样品结果的平均值；误差线表示标准偏差。
图8。
图8。
去除IL-3后，谷氨酸1/HK1细胞和mAkt细胞部分保持NAD（P）H水平。对照（Neo）、谷氨酸1/HK1和mAkt细胞在IL-3（A）的存在下生长或从IL-3（B）中提取12 h。然后对细胞进行NAD（P）h荧光的荧光光谱分析，以确定每种细胞类型的总NAD（P）h含量、线粒体可及胞质可及NAD（PH）h含量。建立荧光基线后，用原核细胞FCCP刺激线粒体NADH氧化（垂直线处添加）。然后，通过观察添加mPyruvate（在垂直线上添加）后NADH荧光随时间的减少来估计每个样品的细胞液NADH含量。通过细胞溶质酶乳酸脱氢酶的作用，mPyruvate导致细胞溶质NADH的耗竭。（C） 在有IL-3或无IL-3的情况下12小时后，在对照细胞、谷蛋白1/HK1和mAkt细胞中测定戊糖磷酸穿梭活性。所示值是三份样品结果的平均值；误差线表示标准偏差。
图9：。
图9：。
在缺乏IL-3的情况下，谷氨酸1和HK1的共同表达可提高生存率，并防止Bax构象的改变。（A） 从IL-3中提取细胞，并通过流式细胞术通过碘化丙啶排除法测量不同时间点的存活率。所示值是三份样品细胞存活结果的平均值；误差线表示标准偏差。（B） 通过流式细胞术测量在IL-3中维持或从IL-3中提取12 h的细胞中Bax的活化。给出了Bax构象变化阳性细胞的百分比。（C） 对照（Neo）和mAkt表达细胞在葡萄糖或IL-3存在或不存在的情况下培养12 h，如图所示，并测定Bax活化的细胞百分比。（D） 对照组（a）、谷氨酸1/HK1（b）、mAkt（c）和Bcl-xL（D）过度表达的FL5.12细胞在不含IL-3的情况下培养，无论是否含有糖酵解抑制剂IAA（实线）。培养开始后不同时间点的细胞存活率通过碘化丙啶排除流式细胞术测定。所示值是三份样品细胞存活结果的平均值；误差线表示标准偏差。
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