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.2003年9月15日；171(6):3287-95.
doi:10.4049/jimmunol.171.6.3287。

高效的TCR基因转移到原代人淋巴细胞中可以提供对黑色素瘤抗原糖蛋白100的强烈识别，并且不会改变对自体黑色素瘤抗体的识别

理查德·摩根 1, 马克·E·达德利, Yik Y L Yu先生, Zhili Zheng郑志立, 保罗·罗宾斯, 马克·雷特, 约翰·伦德利希, 玛丽贝思·S·休斯, 尼古拉斯·P·雷斯蒂福, 史蒂文·罗森博格
附属公司

高效的TCR基因转移到原代人淋巴细胞中可以提供对黑色素瘤抗原糖蛋白100的强烈识别，并且不会改变对自体黑色素瘤抗体的识别

理查德·摩根等。 免疫学杂志. .

摘要

从一个高亲和力的抗gp100 CTL克隆中分离出TCR的α链和β链，并用于构建逆转录病毒载体，该载体可以介导高效基因转移到原始人类淋巴细胞中。通过Western blot分析、免疫细胞分析和HLA-Ag四聚体染色证实了该TCR基因的表达。在不选择转导细胞的情况下，通过在添加淋巴细胞之前将逆转录病毒载体预结合到细胞培养血管的方法，将>50%的基因转移到原代淋巴细胞中。转导细胞的生物活性通过与用gp100肽脉冲但不与无关肽脉冲的刺激细胞共培养后的细胞因子产生得到证实。通过高水平的细胞因子产生（>200000 pg/ml IFN-gamma）、低水平的肽识别（<200 pM）、，并通过HLAⅠ类限制性识别和裂解黑色素瘤细胞系。用该抗gp100 TCR基因工程的CD4（+）T细胞具有Ag反应性，表明表达的TCR具有CD8非依赖性活性。最后，抗gp100 TCR基因转移后，非黑色素瘤反应性肿瘤浸润淋巴细胞培养物产生抗黑色素瘤活性。此外，对非gp100黑色素瘤Ags具有反应性的肿瘤浸润淋巴细胞获得了gp100反应性，并且在gp100 TCR基因转移后没有失去对自体黑色素瘤Ags的识别。这些结果表明，通过基因工程表达抗gp100 TCR的淋巴细胞可能在黑素瘤患者的过继免疫治疗中具有价值。

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数字

图1
图1
表达TCR逆转录病毒载体。A类，用于从CTL克隆R6C12转移和表达TCR基因的两个逆转录病毒载体的示意图。在载体GCsamgp100APB（APB）中，α链的表达由载体LTR介导，而β链的表达则由内部PGK基因启动子驱动。在载体Gcsapgp100BIA（BIA）中，两条链的表达均由LTR介导，翻译通过使用IRES元件耦合。逆转录病毒载体包装信号（ψ）、剪接供体（sd）和剪接受体（sa）位点的位置如图所示。B类、来自Sup T1细胞的CD3-反应细胞的FACS直方图，或用APB或BIA载体转导的Sup T1-细胞。阳性染色细胞百分比如图所示。C类用抗CD3抗体加gp100四聚体双重染色Sup T1细胞的FACS图谱。如图所示，用APB或BIA载体转导的Sup T1细胞或Sup T1细胞的图谱显示了相应的阳性细胞百分比。
图2
图2
TCR载体转导的初级人类PBL。模拟转导（无载体，NV）或用TCR载体APB或BIA转导的PBL的FACS图谱。如图所示，细胞用抗Vβ8加抗CD3双重染色，阳性细胞百分比。A类，患者1。B类，患者2。
图3
图3
细胞因子分泌对gp100肽稀释液的敏感性。显示TCR载体转导的PBL暴露于用gp100肽稀释液脉冲的T2细胞后产生的细胞因子分泌。A类和B类，数据来自患者1的PBL。C类和D类，患者2的数据。样本包括：无载体转导细胞（NV）、对照YFP载体转导电池（YFP）、抗gp100 TCR载体转导的细胞APB和BIA、抗gp100-CTL（R6C12）和抗黑素瘤TIL（TIL）。
图4
图4
转导CD8细胞的细胞内细胞因子染色。所示为患者1的对照PBL或用TCR载体APB或BIA转导的PBL的FACS直方图。细胞与用HLA-A2特异性流感病毒肽（Flu）或gp100肽209-217（210M）脉冲的T2细胞共培养。细胞门控CD3-+CD8-阳性细胞，然后分析CD69+细胞内IFN-γ的表达。门控盒中阳性细胞的百分比如图所示。
图5
图5
黑色素瘤细胞系的溶解。患者1的PBL(A类和B类)或2(C类和D类)在一个51铬释放试验。转导或对照PBL（见图例）与HLA-A2阳性黑色素瘤细胞系526共培养(A类和C类)或非HLA-A2 888黑色素瘤细胞系(B类和D类)被贴上标签的51Cr.细胞以指示的E:T比率孵育4小时，然后计算目标细胞的溶解百分比。指示的CTL线路用作控制；详见正文。样本包括：无载体转导细胞（NV）、对照YFP载体转导电池（YFP）、抗gp100 TCR载体转导的细胞APB和BIA以及抗gp100 CTL（R6C12、CK3H6和D4F12）。
图6
图6
TCR转导的CD4细胞产生细胞因子。A类，使用磁珠和CD4去除患者1的PBL中的CD8细胞+与带有流感肽（Flu）或gp100肽209-217（210M）脉冲的T2细胞共培养的细胞。20小时后，测定IFN-γ的产生量。B类，患者2暴露于经gp100:209–217（210M）脉冲处理的T2细胞后PBL的FACS曲线。将未转导细胞（对照）或TCR载体转导的细胞（APB和BIA）门控CD3+CD4阳性细胞，然后分析CD69+细胞内IFN-γ的表达。门控盒中阳性细胞的百分比如图所示。
图7
图7
抢救非反应性TIL培养物。对来自三名黑色素瘤患者的TIL培养物进行测试，并确定其对HLA匹配的黑色素瘤细胞系无反应。用对照YFP载体或TCR载体APB转导TIL，然后与肽脉冲T2细胞共培养。显示了共培养后每个患者的代表性细胞因子产生。使用的肽是流感病毒（Flu）黑色素瘤抗原MART-1（MART）或gp100:209-217的HLA-A2特异性肽。
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