Chimeric influenza A viruses with a functional influenza B virus neuraminidase or hemagglutinin

doi:10.1128/jvi.77.17.9116-9123.2003

.2003年9月；77(17):9116-23.

doi:10.1128/jvi.77.17.9116-9123.2003。

带有功能性流感B病毒神经氨酸酶或血凝素的嵌合甲型流感病毒

阿斯特里德·弗兰多弗¹, 阿道夫·加西亚·萨斯特雷, 克里斯托弗·巴斯勒, 帕雷斯

附属公司

PMID： 12915528
预防性维修识别码：项目经理187417
DOI（操作界面）： 10.1128/jvi.77.17.9116-9123.2003年

带有功能性流感B病毒神经氨酸酶或血凝素的嵌合甲型流感病毒

阿斯特丽德·弗兰多夫等。 J维罗尔. 2003年9月.

.2003年9月；77(17):9116-23.

doi:10.1128/jvi.77.17.9116-9123.2003。

作者

阿斯特里德·弗兰多弗¹, 阿道夫·加西亚·萨斯特雷, 克里斯托弗·巴斯勒, 帕雷斯

附属

¹美国纽约州纽约市西奈山医学院微生物系，邮编：10029。

PMID： 12915528
预防性维修识别码：项目经理187417
DOI（操作界面）： 10.1128/jvi.77.17.9116-9123.2003年

摘要

从未在体内或体外观察到甲型和乙型流感病毒的重组。利用反向遗传学技术，我们产生了携带B型流感病毒神经氨酸酶（NA）的重组流感A/WSN/33（WSN）病毒。表达全长流感B/Yamagata/16/88病毒NA的嵌合病毒的滴度与野生型流感WSN病毒相似。重组病毒中，B型NA的胞质尾或胞质尾和跨膜结构域被A型NA的替换，在组织培养中受到破坏。这一发现与病毒中NA含量降低有关。我们还生成了一种表达嵌合血凝素（HA）蛋白的重组甲型流感病毒，其中外结构域源自B/Yamagata/16/88型病毒HA，而细胞质和跨膜结构域均源自a/WSN型病毒HA。这种A/B嵌合HA病毒在MDCK细胞中不能有效生长。然而，在连续传代后，我们获得了一个病毒群，其滴度在MDCK细胞中增长到与野生型甲型流感病毒一样高。545位（H545Y）的一个氨基酸变化被发现是传播病毒生长特性增强的原因。综上所述，我们在这里表明，属于不同A型和B型的流感病毒之间不存在重配并不是由于全长NA或HA外结构域水平的棘突糖蛋白不相容所致。

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数字

**图1。**
NA和HA基因用于产生重组流感A/WSN病毒。（A）流感病毒B/Yamagata/16/88和A/WSN/33亲本和嵌合NA基因的示意图，显示了NA的ORF。NCR用线条表示。CT，细胞质尾；EC，外结构域；TM，跨膜结构域。在BNA/A65和BNA/ACT-ATM中，NCR分别通过将65 nt插入3′NCR（nt 20至84）和36 nt（nt 1298至1333）插入5′NCR而扩展。流感病毒B wt NA、流感病毒B/山形病毒NA；流感病毒A wt NA，流感病毒A/WSN野生型病毒NA。流感病毒B野生型NA中的星号表示NB蛋白起始密码子的位置，该起始密码子位于NA蛋白的上游。NB蛋白氨基末端的上游序列编码不包括在嵌合结构中。（B） B/Yamagata/16/88和A/WSN/33流感病毒HA和嵌合BHA-ACT/ATM片段的示意图。流感病毒B wt HA、流感病毒B/山形病毒HA；流感A wt HA、流感A/WSN野生型病毒HA。ORF显示为方框。NCR用线条表示。CT，细胞质尾部；EC，外结构域；TM，跨膜结构域。有关详细信息，请参见材料和方法。

**图2。**
重组病毒感染MDCK细胞的免疫荧光分析。（A）表达重组B型流感病毒NA的重组A型流感病毒。子面板：A和D，野生型流感B/山形病毒，B和C，野生型甲型流感/WSN病毒；E和F，WSN-BNA病毒；G和H，WSN-BNA/A65病毒；I和J，WSN-BNA/ACT病毒；K和L，WSN-BNA/ACT-ATM病毒。（B）表达B型流感病毒HA外区的重组A型流感病毒。子面板：A和B，模拟感染；C和D WSN-BHA/ACT-ATM病毒。αFlu B NA和αFlu B-HA，分别识别流感B/山形病毒NA（9A6）或HA（15B6）的单克隆抗体；αFlu A，抗A/WSN病毒的多克隆兔抗血清（即8236）。

**图3。**
重组流感病毒的生长特性。用rWSN（⋄）、WSN-BNA（\）、WSN-BNA/A65（▵）、WSN-BNA/ACT以0.001的MOI感染MDCK细胞(▪), 和WSN-BNA/ACT-ATM（□）病毒（A）或野生型WSN(♦) 和WSN-BHA/ACT-ATM（第6页[▪] 和H545Y[□]）病毒（B）。对MDCK细胞进行菌斑分析。感染后h p.i.小时。

**图4。**
流感A/WSN和重组WSN-BHA/ACT-ATM（P6）病毒的蛋白凝胶分析。纯化病毒的蛋白质，无论是未经处理的（−）还是经PNGase F（+）处理的，均在12%的凝胶上用SDS-PAGE分离，并用考马斯亮蓝染色。显示了未处理（−）和处理（+）蛋白质的位置。添加的PNGase F带显示在右侧的箭头处。脱糖流感A/WSN HA的位置₁（甲流HA₁)和WSN-BHA/ACT-ATM（Flu B HA₁)病毒用右边的箭头表示。哈₀，HA前体蛋白；哈₂、HA₂HA亚单位。

**图5：。**
ELISA法测定纯化嵌合病毒中B型流感病毒NA的含量。ELISA板涂有50μl重组纯化WSN-BNA（▴）、WSN-BNA/A65（\9652；）、WSN-BNA/ACT的连续两倍稀释液(▪), WSN-BNA/ACT-ATM（□）和野生型B/山形病毒（⋄）。起始浓度为5μg/ml。平板与B型流感病毒NA-特异性单克隆抗体（9A6）孵育，并与二级辣根过氧化物酶结合的抗鼠IgG一起培养。

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[1] Baigent，S.J.和J.W.McCauley。2001.血凝素的糖基化和神经氨酸酶的茎长结合起来调节组织培养中禽流感病毒的生长。病毒研究79:177-185。-公共医学

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