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.2003年8月；23(16):5738-54.
doi:10.1128/MCB.23.16.5738-5754.2003。

小鼠乳腺肿瘤病毒c-rel转基因小鼠发生乳腺肿瘤

拉斐尔·罗米厄·穆雷斯 1, 董维金（Dong W Kim）, 桑敏欣, 伊丽莎白·德米科, 埃丝特·兰德斯曼-博拉, 大卫·塞尔丁, 罗伯特·卡迪夫, 盖尔·索伦申
附属公司

小鼠乳腺肿瘤病毒c-rel转基因小鼠发生乳腺肿瘤

拉斐尔·罗米尤·穆雷斯等。 分子细胞生物学. 2003年8月.

摘要

编码c-rel NF-kappaB亚单位的c-rel基因的扩增、过表达或重排在实体和造血恶性肿瘤中已有报道。例如，许多原发性人类乳腺癌组织样本表达高水平的核c-Rel。虽然Rev-T癌基因v-Rel会导致鸟类肿瘤，但尚未证明c-Rel在体内转化的能力。为了直接测试c-Rel在乳腺肿瘤发生中的作用，产生了小鼠，其中小鼠c-Rel cDNA的过表达是由激素反应性小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复序列（MMTV-LTR）启动子驱动的，并鉴定了四个建立系。在妊娠的第一个周期中，观察到转基因c-rel mRNA的表达，乳腺中c-rel蛋白的水平升高。重要的是，31.6%的小鼠在平均19.9个月大时发生了一个或多个乳腺肿瘤。乳腺肿瘤组织学多样，核NF-kappaB表达增加。对肿瘤中NF-κB复合物组成的分析揭示了多个亚基的异常核表达，包括c-Rel、p50、p52、RelA、RelB和Bcl-3蛋白，如先前在人类原发性乳腺癌中观察到的那样。癌症相关NF-kappaB靶基因cyclin D1、c-myc和bcl-xl的表达在开始第一个妊娠周期的大体正常的转基因乳腺中显著增加，并且与野生型小鼠或原始转基因小鼠的乳腺相比，在乳腺癌中进一步增加。在未转化乳腺上皮细胞的瞬时转染分析中，c-Rel-p52或-p50异二聚体分别有效或适度地诱导cyclin D1启动子活性。最后，c-Rel的稳定过度表达导致细胞周期蛋白D1、NF-kappaB p52和p50亚基蛋白水平增加。这些结果首次表明，如在乳腺癌中观察到的那样，c-Rel的异常表达能够促进乳腺肿瘤的发生。

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数字

图1。
图1。
MMTV-LTR驱动c-相对转基因在FVB/N小鼠中的表达。（A） 创始人系列的识别。从指定的潜在创始人MMTV-c中制备基因组尾部DNA-相对转基因小鼠和用Pst（磅/平方英尺）并对c进行Southern blot分析-相对使用2.2 kb的片段，包括MMTV-LTR启动子和小鼠c的~1kb片段-相对从MMTV-c发布的cDNA-相对用酶消化的质粒Pst（磅/平方英尺）一、 作为探针。从c导出的带的位置-相对转基因与内源性c-相对湿度基因如图所示。（B） 转基因c-相对表达。从野生型FVB/N或品系14MMTV-c的指示器官中分离总RNA-相对在第一次怀孕的第18.5天，对小鼠进行DNA酶处理。样品（5μg）在有（+）或无（-）RT的情况下进行RT-PCR分析，以控制DNA污染，使用c-相对转基因特异性寡核苷酸，扩增236-bp片段。对β-肌动蛋白RNA水平的类似分析证实了逆转录反应的完整性。（C） C-Rel总表达。在第一次怀孕的第18.5天，从WT FVB/N或指定的转基因系小鼠中移除乳腺。制备核提取物，并对样品（20μg）进行c-Rel和Sp1的免疫印迹分析，作为装载对照。作为额外的对照，对WEHI 231未成熟B淋巴瘤细胞的核提取物和WCE进行了类似的分析，这些细胞表达高组成水平的c-Rel（40）。c-Rel相对于WT样本归一化为Sp1水平的值如下所示。
图2。
图2。
MMTV-c乳腺肿瘤的典型组织病理学-相对转基因小鼠经过多次妊娠和退化。（A） 腺癌；（B） 乳腺癌小鼠肺转移；（C） 腺鳞状细胞癌显示细胞外鳞状细胞分化区域（箭头）；（D） 鳞状细胞癌；（E） 梭形细胞癌；（F） 免疫组化检测细胞角蛋白8在梭形细胞癌中的表达，如2E所示。注意腺体中许多梭形细胞的染色和管腔上皮的染色（箭头所示）。
图3。
图3。
c-Rel在转基因雌性MMTV-c中的表达-相对乳腺肿瘤。从原始野生型FVB/N（WT-virgin）或转基因系16（16-Virging）小鼠以及多胎系14和16转基因小鼠的肿瘤（T）和大体正常（N）组织中去除乳腺。括号中显示了给单个小鼠的识别号。肿瘤样本的特征见表1。（A） 转基因c-相对表达。从乳腺和肿瘤组织中制备RNA，并用转基因c特异性引物对样品进行RT-PCR-相对，如图1的图例所示。（B） 总蛋白c-Rel表达。制备核提取物，并对样品（40μg）进行c-Rel水平的免疫印迹分析。使用SDS-PAGE凝胶的考马斯蓝染色作为等负荷对照（底部面板）。虽然整体染色水平基本相同，但分析表明，肿瘤、WT和正常转基因乳腺样品之间的蛋白质表达模式不同。这种差异可能是由于这些组织中细胞类型组成的差异造成的。
图4。
图4。
多媒体电视-c-相对肿瘤显示NF-κB结合增强。（A） 核提取物由MMTV-c制备-相对第15行（127）小鼠乳腺肿瘤和大体正常乳腺，以及接受EMSA检测NF-κB结合的样品（5μg）。为了鉴定亚基组成，在不存在（−）或存在对p50特异性的超转移抗体或对C-Rel特异性的阻断抗体的情况下，将所示样品在4°C下孵育过夜。所鉴定的p50/C-Rel和p50同源二聚体复合物的位置如图所示。（B和C）从14号系3996乳腺肿瘤（3996R1 T）和大体正常乳腺（N）中制备核提取物，并对样品（5μg）进行NF-κB（B）EMSA和Oct-1（C）作为负荷对照。对于超位移分析，在没有（−）或存在p50、RelA、C-Rel（sc-70）和RelB特异性超位移抗体的情况下，将样品在4°C下培养过夜。箭头显示c-Rel超移复合体的位置。如有指示，在同一实验中，表达高水平c-Rel/p50复合物（40）的WEHI 231 B细胞的核提取物（5μg）被分析为阳性对照，但WEHI 231样品的暴露量较轻。（D） 从第14 3996行乳腺肿瘤（3996 T）中制备核提取物，在不存在或存在上述c-Rel特异性抗体的情况下，使用WEHI 231核提取物对样品（5μg）进行NF-κB EMSA检测。插图表示图中所示超移带区域的较暗曝光。
图5：。
图5：。
多媒体电视-c-相对肿瘤表达多个NF-κB亚单位和Bcl-3蛋白。从显示的乳腺肿瘤、经产系14 MMTV-c的大体正常乳腺（N）中制备细胞核提取物-相对小鼠，以及来自WT初产FVB/N小鼠（WT处女）的乳腺。如图3B所示，对样品（40μg）进行免疫印迹分析，以检测p50、RelA、RelB和p52 NF-κB亚基和Bcl-3蛋白的表达。指出了分子质量标记的位置。
图6。
图6。
多媒体电视-c-相对乳腺和癌症过度表达细胞周期蛋白D1 mRNA。（A）乳腺。在第一次怀孕的第18.5天，从3到6个月大的小鼠或WT FVB/N小鼠的乳腺中制备总RNA。RT-PCR：RNA经过DNA酶处理，对溴化乙锭染色凝胶的分析验证了质量和基本相等的负载（数据未显示）。样品（5μg）在有（+）或无（-）RT的情况下，进行细胞周期蛋白D1和β-肌动蛋白mRNA水平的RT-PCR分析，以控制DNA污染。对于β-肌动蛋白mRNA分析，在30个PCR循环后，水平似乎饱和，并且在所有测试的样品中都是相同的，而在20个PCR循环以下检测不到水平（数据未显示），因此选择25个PCR循环进行标准化。将细胞周期蛋白D1信号强度归一化为β-肌动蛋白mRNA水平的值显示为相对于WT（3）样本的值。RNA样品（5μg）采用放射性标记的人全长细胞周期蛋白D1 cDNA作为探针，进行细胞周期蛋白D 1基因水平的Northern blot分析。28S rRNA的溴化乙锭染色用作装载对照。下面给出了相对于WT（3）归一化为28S rRNA的细胞周期蛋白D1信号的值。ND，扫描无法检测。（B） 乳腺癌。从年龄相关的多胎系14和16 MMTV-c的指示乳腺肿瘤（T）和大体正常乳腺（N）中制备总RNA-相对小鼠，以及来自处女（V）转基因小鼠乳腺。如上所述，对RNA样品（5μg）进行半定量RT-PCR分析，以评估细胞周期蛋白D1 mRNA水平。将细胞周期蛋白D1信号强度归一化为β-肌动蛋白RNA水平的值显示为相对于16号线（4948 N）正常样品的值（在较暗的曝光下更好地看到）。如上所述，对RNA样品（5μg）进行Northern blot分析，以评估细胞周期蛋白D1 mRNA水平。与15（8441）相比，将细胞周期蛋白D1信号归一化为28S rRNA的值如下所示。ND，扫描无法检测。
图7。
图7。
MMTV-c细胞周期蛋白基因表达谱-相对小鼠乳腺和肿瘤。从年龄相关的多胎系14和16 MMTV-c的指示乳腺肿瘤（T）或大体正常乳腺（N）中制备总RNA-相对老鼠。对RNA样本（5μg）进行RPA分析，以评估细胞周期蛋白A1、A2、B1、B2、C、D1、D2和D3以及L32和GAPDH看家基因的mRNA水平。左右面板显示了两组分析数据。使用未消化探针作为标记物和小鼠的对照RNA，建立了RNase保护带的特性细胞周期蛋白试剂盒提供的mRNA表达（数据未显示）。
图8。
图8。
多媒体电视-c-相对肿瘤过度表达c-myc公司mRNA。（A） 乳腺。从乳腺和样品（15μg）中制备总RNA，并对其进行Northern c分析-myc公司mRNA表达。作为对照，凝胶用溴化乙锭染色，如下所示。c的相对值-myc公司相对于WT（2）原始样本，给出了归一化为28S rRNA水平的信号强度。（B） 乳腺肿瘤。从年龄相关的多胎系14和16 MMTV-c的指示乳腺肿瘤（T）和大体正常乳腺（N）中提取总RNA-相对老鼠。此外，从未生育转基因品系16小鼠（16处女）的乳腺中分离出RNA。对RNA样品（20μg）进行Northern c分析-myc公司mRNA表达。作为RNA完整性和等负荷的对照，凝胶用溴化乙锭染色，RNA样品接受RT-PCR分析，以检测β-肌动蛋白mRNA水平（图3）。c的值-myc公司信号强度归一化为28S rRNA水平，相对于第16行原始样本，如下所示。
图9：。
图9：。
MMTV-c中Bcl-2家族成员基因表达谱-相对小鼠乳腺和肿瘤。从年龄相关的多胎系14和16 MMTV-c的指示乳腺肿瘤（T）和大体正常乳腺（N）中制备RNA-相对老鼠。对样品（5μg）进行RPA分析，以评估Bcl-2家族成员基因的mRNA水平，即。，bfl-1/a1型，B细胞淋巴瘤/白血病-xl基因，bax（巴克斯），烘烤，bcl-2基因、和坏的、L32和GAPDH管家基因。使用未消化探针作为标记物和试剂盒中提供的小鼠凋亡基因表达的控制RNA（数据未显示），确定RNase保护带的身份。
图10。
图10。
多媒体电视-c-相对乳腺和癌过度表达B细胞淋巴瘤/白血病-xl基因mRNA。（A） 乳腺。在第一次怀孕的第18.5天，从指示的3-6月龄转基因小鼠和WT FVB/N中制备总RNA。RT-PCR：对样品（5μg）进行RT-PCR分析B细胞淋巴瘤/白血病-xl基因β-actin mRNA水平，如图6所示。的值B细胞淋巴瘤/白血病-xl基因相对于WT（2）样本，信号强度归一化为β-actin mRNA水平。Northern blot：对样品（5μg）进行Northern blot分析B细胞淋巴瘤/白血病-xl基因mRNA水平，使用小鼠B细胞淋巴瘤/白血病-xl基因cDNA作为探针，如图6所示。的值B细胞淋巴瘤/白血病-xl基因WT样本的信号低于检测水平。（B） 乳腺癌。从指示的乳腺（处女[V]或多胎大体正常[N]）或肿瘤（T）中制备总RNA，并对样品（5μg）进行半定量RT-PCR或Northern blot分析，以评估mRNA水平B细胞淋巴瘤/白血病-xl基因，如上所述。的值B细胞淋巴瘤/白血病-xl基因RT-PCR分析中标准化为β-actin mRNA水平的信号强度相对于16号线（4948）正常样本显示，而B细胞淋巴瘤/白血病-xl基因在Northern杂交分析中，处女和正常样本的信号低于检测水平。
图11。
图11。
c-Rel异二聚体复合物诱导细胞周期蛋白D1启动子。使用−66 WT-cyclin D1或−66 Mut-cyclin D1荧光素酶基因报告子构建物和0.5μg pSV40-β-gal，在NF-κB或Bcl-3质粒表达载体存在的情况下，重复转染NMuMG细胞。48小时后，收集培养物，对β-Gal活性进行标准化，并对荧光素酶活性进行分析。给出了荧光素酶活性的标准值（误差条、标准偏差）。
图12：。
图12：。
人MCF-10F未转化乳腺上皮细胞异位c-Rel表达可诱导细胞周期蛋白D1、p52和p50表达水平。用pSVSport-c-Rel（c-Rel）和pGKpuro质粒表达载体共同转染细胞，并用嘌呤霉素选择混合细胞群。从转染细胞和亲代未转染细胞（对照）制备WCE，并使用两个相同的印迹（用不同抗体连续复制）对样品（10μg）进行c-Rel、RelA、p52/p100、p50/p105、cyclin D1和β-actin水平的免疫印迹分析。为了更好地显示p105和p50波段，使用了更长的曝光时间。
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