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.2003年8月5日；100(16):9280-5.
doi:10.1073/pnas.0832269100。 Epub 2003年7月25日。

可视化单个流感病毒的感染

梅利克·拉卡达米亚利 1, 迈克尔·J·鲁斯特, Hazen P Babcock公司, 庄晓伟
附属公司

可视化单个流感病毒的感染

梅利克·拉卡达米亚利等。 美国国家科学院程序. .

摘要

流感是理解病毒感染的范例。作为一种利用细胞内吞机制进行感染的机会性病原体，流感也是探索细胞组成性内吞途径的一个有价值的模型系统。我们利用实时荧光显微镜研究了单个流感病毒在活细胞中的运输、酸化和融合，并解剖了病毒进入途径的各个阶段。单个病毒的运动揭示了一个引人注目的三阶段主动转运过程，在病毒与内体融合之前，首先是细胞外周的肌动蛋白依赖性运动，然后是快速的强啡肽定向易位到核周区，最后是一种间歇运动，包括核周区正负向微管运动。令人惊讶的是，大多数病毒在达因导向的快速易位步骤之后，会立即在核周区域经历初始酸化。这一发现表明，向晚内吞体的内吞途径存在一种以前未描述的情况：内吞体成熟，包括初始酸化，主要发生在核周区域。

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数字

图1。
图1。
CHO中单个流感病毒的荧光图像和融合位点细胞。(一)CHO细胞的DIC图像(左侧)和荧光DiD标记病毒2分钟图像(居中)和15分钟(赖特)感染后。细细的白线追踪着核边界。(b)单个病毒的融合位点标记为红星。细胞和细胞核的边界被厚厚的灰色和白色细线。单元格之间的边界为在驾驶员信息中心（DIC）图像中可以识别出清晰的轮廓。原子核是可见为高对比度包围的细胞中心附近的卵圆形区域囊泡结构。看起来似乎在原子核内的恒星最有可能表明核上方或下方的融合事件。
图2。
图2。
追踪单个流感病毒的传播和融合。(一)DiD标记病毒在细胞内的轨迹。的颜色轨迹编码时间，彩色条表示统一的时间轴从0秒（黑色）到500秒（黄色）。红星表示聚变地点。（比例尺：10μm）(b)速度的时间轨迹（黑色）以及病毒的DiD荧光强度（蓝色）。t吨1,t吨2、和t三是阶段I、II和III的持续时间，分别是。每种病毒的第二阶段运动都可以被一致识别细胞外周快速单向移位的轨迹到核周区域。第一阶段定义为在此之前的时期瞬态运动，第三阶段被定义为第二阶段之后的阶段，但融合前。(c（c）)第一阶段病毒传播速度直方图。(插入)所示为测量的平均均方位移（Δr2〉）vs.病毒的时间（Δt）（绿色符号）。绿线适合Δr2〉 =常数+DΔt+（vΔt）2D=0.001微米2/s和v=0.02μm/s。小常数项是由于噪音。第一阶段约60%的病毒轨迹表现出超线性Δr的相关性2〉Δt。因为运动的扩散型分量（DΔt），瞬时速度直方图中（=Δr/Δt）取决于Δt，选择Δt是为了0.5 s英寸c（c）–e（电子）. (d日)病毒直方图第二阶段的速度。(e（电子）)阶段病毒传播速度直方图三、(插入)所示为的典型示例ΔΔr2〉与Δt。代表第三阶段相对较快的运动，Δr2〉vs.Δt图仅使用病毒所在的点进行计算以>0.3μm/s的速度行驶。绿线是第一条线的拟合Δr的八个数据点2〉=常数+D′Δt+（v′Δt）2D′=0.5微米2/s和v′=0.4μm/s。小常数项到期噪音。
图3。
图3。
药物和抗体对病毒转运特性的影响。(一)未经治疗的前100秒病毒运动的病毒轨迹，细胞-D处理的细胞和诺卡唑处理的细胞。箭头在上部赖特表示最小半径(第页跳跃)的以轨迹原点为中心的圆，可以覆盖整个轨迹在给定时间的轨迹。(b)平均值第页跳跃在许多轨道上作为时间的函数。这个第页跳跃在未经处理和诺卡唑处理的细胞中快速检测超过r跳跃在细胞-D处理的细胞中获得。快速，首次增加第页跳跃在细胞-D处理曲线中可能是由于病毒传播受限或而固定在玻璃上的病毒则不会发生。(c（c）)病毒未经处理细胞、诺卡唑处理细胞、，以及注射抗达因素（1mg/ml）的细胞。时间色标类似如图2所示。（比例尺：10μm）
图4。
图4。
跟踪单个流感病毒的传播和酸化。(一)细胞内Cy3/CypHer5标记病毒的轨迹。这个彩色条表示从0到450秒的统一时间轴。绿色星表示初始酸化位置。（比例尺：10μm）(b)速度的时间轨迹（黑色）以及CypHer5和Cy3的比率病毒的荧光发射（红色）。t吨4定义时间在第二阶段结束和初始酸化事件之间经过。这个pH值根据校准的pH依赖性进行标记CypHer 5和Cy3之间的强度比（未显示数据）。(c（c）)t的直方图三和t4如图。2b和4b,分别是。
图5。
图5。
晚期内吞体的内吞途径模型。(1)病毒在肌动蛋白中内化并运输到早期内体（EE）（AT）依赖方式（第一阶段运动）。(2)含有病毒的内吞室使EE保持在细胞外pH值通过携带病毒的内吞载体囊泡（ECV）萌发发生来自EE（13，27）或富膜EE再循环的管状区域，以留下含有病毒（33）。(三)ECV或囊泡EE通过微管上的动力蛋白定向运动（MT）（第二阶段运动）。(4)ECV或囊泡EE通过以下方式成熟为成熟内体（ME）改变膜结合运动蛋白活性（从第二阶段过渡第三阶段运动）。(5)内体通过改变进一步成熟其pH从细胞外值到pH≈6（初始酸化为由CypHer 5和Cy3之间荧光比率的变化表示与病毒缀合）。(6)进一步酸化会使pH值内体至晚期内体（LE）值，pH≈5（二次酸化如病毒融合所示）。
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