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.2003年7月22日；100(15):8817-22.
doi:10.1073/pnas.1133470100。 Epub 2003年7月11日。

将单个DNA分子转化为荧光磁粉用于检测和计数遗传变异

德文·德雷斯曼 1, 海燕, 乔瓦尼·特拉弗索, 肯尼思·金兹勒, 贝尔特·福格尔斯泰因
附属公司

将单个DNA分子转化为荧光磁性粒子，用于检测和计数遗传变异

德文·德雷斯曼等。 美国国家科学院程序. .

摘要

生物医学研究的许多领域都依赖于对单个基因或转录本中罕见变异的分析。在这里，我们描述了一种方法，这种方法可以在一个尺度上量化这种变化，并且容易迄今为止无法实现。这些分子集合中的每一个DNA分子都被转换成一个单一的磁性粒子，数千个与原始DNA序列相同的DNA拷贝被绑定到这个磁性粒子上。这些珠子的数量对应于起始DNA分子的一对一表示。然后，通过流式细胞术计数荧光标记的颗粒，可以简单地评估DNA分子原始群体内的变化。这种方法根据其四个主要成分（珠子、乳液、放大和磁性）被称为BEAMing。数以百万计的单个DNA分子可以用标准实验室设备以这种方式进行评估。此外，可以通过流式分选分离出特定的变体，并用于进一步的实验。BEAMing可用于鉴定和量化罕见突变，以及研究特定人群或组织中基因序列或转录物的变异。

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图1。
图1。
横梁示意图。步骤1：共价涂覆磁珠链霉亲和素与生物素化寡核苷酸（oligos）结合。第二步：含水混合物，含有PCR和底漆结合的所有必要成分将珠子和模板DNA与油/洗涤剂混合物搅拌在一起创建微乳液。含水隔室（灰色油中的白色圆圈层）包含少于一个模板分子和少于一个的平均值有孔小珠。红色和绿色模板代表两个模板分子，序列其中一个或多个核苷酸不同。步骤3：微乳液是温度循环与传统PCR相同。如果DNA模板和珠子在一个单独的水室中，珠子结合在一起寡核苷酸作为扩增引物。笔直的红色和绿色连接到珠子的线表示两个珠子的延伸产品不同类型的模板。第四步：乳状液破碎，珠子用磁铁净化。步骤5：变性后，珠子用能够区分不同类型的模板。荧光标记抗体用于标记结合的杂交探针，从而呈现珠子在适当的激光激发后，PCR产物呈红色或绿色。第6步：使用流式细胞仪对红色和绿色珠子进行计数。
图2。
图2。
典型微乳液的照片。微乳的制备方法如下中描述的材料和方法例外情况是水室中含有级联蓝标记的dCTP，珠为通过结合与R-藻红蛋白偶联的寡核苷酸（红色）或Alexa 488（绿色）。1微升微乳沉积在1摄影前在显微镜载玻片上放置μlofoil。在七种水溶液中这张照片中的隔间里有两个装有珠子。请注意水室的异质尺寸（珠为1.05μm in直径）。
图3。
图3。
从BEAMing获得的流式细胞仪数据的密度图。轨迹在这个实验中被质疑的是中频42和PCR产物产生于基因组DNA被用作微乳中的模板。(A类)前进所有珠子的散射（FSC）和侧面散射（SSC）表明≈80%所有的珠子都是单粒的，剩下的大部分珠子聚集在一起双人床。“噪音”是仪器性的，用空白观察不含珠子的样品。仪器输出被选通，因此只有单核细胞进行荧光分析。从中观察到的模式个体纯合子我等位基因(A类)，纯合子对于S公司等位基因(B类)和杂合子我和S公司(D类)如所示B类——D类,分别是。含有与我和S公司等位基因探针分别标记为绿色和红色。该地区含有未与任何探针杂交的珠子的区域为黑色含有与两个探针杂交的珠子是蓝色的。蓝色珠子升起来自两种模板分子都在其中的水腔室目前。与至少一个探针分别为2.9%、4.3%和20.3%B类——D类,分别是。中的正向散射和侧向散射图A类表示在中分析的相同珠子D类.FL1，荧光通道1；FL2，荧光通道2；PE，R-藻红蛋白。
图4。
图4。
以基因组DNA或RT-PCR产物为模板的BEAMing密度图。中的数据A类和B类由10和1生成微乳中人类基因组DNA的μg，查询中频42轨迹。中的数据C类和D类由生成使用含有≈50pg由cDNA合成的PCR产物的乳液淋巴母细胞，查询钙蛋白酶-10轨迹。这个绿色和红色区域对应于我和S公司等位基因中频42并发送至A类和G公司等位基因钙蛋白酶-10轮廓区域中的珠子数每种情况下都会显示包含红色或绿色珠子的图像。单峰比例与至少一种探针杂交的珠子分别为1.2%、0.6%、6.8%和4.2%英寸A类——D类分别是。使用的概述区域用于计数A类和B类与使用的相同对于C类和D类没有与任何探针杂交的珠子选通，因此在图中不明显，并且包含与两个探针杂交的珠子标记为蓝色。FL1，荧光通道1; FL2，荧光通道2；PE，R-藻红蛋白。
图5。
图5。
检测和验证少量DNA中的变异人口。(A类)含0-4%的PCR产物混合物我等位基因中频42用于光束。流式细胞术如图3所示用于测定红色单线珠的比例(年轴）。与至少一个探针的变化范围为3.2%至4.3%。(B类和C类)珠子已分类使用FACSVantage SE仪器，单个红色或绿色珠子作为常规PCR的模板，使用正向和反向表1中列出的引物。红色珠子仅生成S公司等位基因序列，而绿色珠子只产生我等位基因顺序。
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参考文献

    1. Collins，F.S.，Patrinos，A.，Jordan，E.，Chakravarti，A.，Gesteland，R.&Walters，L.（1998）《科学》282，682-689。-公共医学
    1. Vogelstein，B.&Kinzler，K.W.（2002）《人类癌症的遗传基础》（多伦多麦格劳-希尔出版社）。
    1. Sidransky，D.、Von Eschenbach，A.、Tsai，Y.C.、Jones，P.、Summerhayes，I.、Marshall，F.、Paul，M.、Green，P.，Hamilton，S.R.、Frost，P.等人（1991）《科学》252、706–709。-公共医学
    1. Ahlquist，D.A.和Shuber，A.P.（2002）临床。蜂鸣器。学报315157-168。-公共医学
    1. Sidransky，D.（2002）《国家癌症评论》2，210–219。-公共医学

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