Regulated splicing of the fibronectin EDA exon is essential for proper skin wound healing and normal lifespan

doi:10.1083/jcb.200212079

.2003年7月7日；162(1):149-60.

doi:10.1083/jcb.200212079。

纤维连接蛋白EDA外显子的调控剪接对皮肤伤口的正确愈合和正常寿命至关重要

安德烈斯·穆罗¹, 阿尼尔·K·肖汉, 斯雷科·加乔维奇, 亚历山德拉·亚康齐, 法比奥拉·波罗, 乔治·斯坦塔, 弗朗西斯科·巴拉勒

附属公司

PMID： 12847088
预防性维修识别码： PMC2172721型
内政部： 10.1083/jcb.200212079

纤维连接蛋白EDA外显子的调控剪接对皮肤伤口的正确愈合和正常寿命至关重要

安德烈斯·费·穆罗等。 J细胞生物学. 2003.

.2003年7月7日；162(1):149-60.

doi:10.1083/jcb.200212079。

作者

安德烈斯·费·穆罗¹, 阿尼尔·K·肖汉, 斯雷科·加乔维奇, 亚历山德拉·亚康齐, 法比奥拉·波罗, 乔治·斯坦塔, 弗朗西斯科·巴拉勒

附属

¹国际遗传工程和生物技术中心（ICGEB），Padriciano 99，34012 Trieste，Italy。

PMID： 12847088
预防性维修识别码： PMC2172721型
内政部： 10.1083/jcb.200212079

摘要

纤维结合蛋白（FN）是存在于血浆和组织ECM中的多功能高分子量糖蛋白。FN初级转录物在三个区域进行选择性剪接，在人类中产生多达20种不同的主要变体。然而，FN亚型的确切作用尚不清楚。选择性剪接外显子之一是额外结构域A（EDA）或额外类型III同源性，在发育和衰老过程中受到时空调控。为了研究其体内功能，我们制作了没有EDA外显子调控剪接的小鼠。通过优化剪接位点获得组成外显子包含，而在体内CRE-loxP介导的外显子缺失后获得完全排除。完全排除或包含EDA外显子的纯合小鼠菌株是可行的，并且发育正常，这表明在胚胎发育期间，EDA外隐子的选择性剪接是不必要的。相反，FN蛋白中没有EDA外显子的小鼠表现出异常的皮肤伤口愈合，而含有EDA外隐子的小鼠则表现出所有组织中FN水平的显著下降。此外，这两种突变小鼠菌株的寿命都明显短于对照小鼠，这表明EDA剪接调控对于有效长期维持生物功能是必要的。

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数字

**图1。**
**FN基因EDA外显子缺乏调控剪接的小鼠菌株的生成策略。**（A）野生型FN等位基因、靶向载体、靶向等位基因，EDA-floxed等位基因和EDA-null等位基因的部分图谱。外显子、Neo-TK和DTA分别显示为灰色、白色和虚线框。EDA外显子和“loxP”位点分别用黑色正方形和白色三角形表示。N和H分别表示NcoI和HindIII位点。用CRE重组酶表达质粒和EDA瞬时转染重组ES细胞^+/重量用杂合细胞进行囊胚显微注射。EDA公司^+/重量小鼠与表达CRE的转基因小鼠株交配以获得EDA^−/重量老鼠。星号表示NdeI站点。4.0-kb、2.7-kb和2.0-kb的DNA片段（EDA^重量、EDA⁺和EDA⁻用HindIII消化后获得的等位基因，以及用内部探针进行的Southern blot杂交。（B）不同小鼠基因型的Southern blot筛选。EDA公司^重量、EDA⁺和EDA⁻显示了条带。（C） EDA总RNA的RT-PCR分析^{重量/重量}、EDA^+/+和EDA^−/−从肝脏、大脑和肾脏显示。EDA公司⁺和EDA⁻显示了条带（分别为805bp和535bp）。

**图2。**
**EDA的调节拼接对于ECM的形成是必不可少的。**（A） EDA制备MEF总RNA的RT-PCR分析^{重量/重量}、EDA^+/+和EDA^−/−胚胎（受精后13.5天）。（B和C）分别用抗FN和抗EDA抗体对上述MEF（B和C分别为20和100μg）制备的蛋白质提取物进行Western blot分析。考马斯蓝染色显示等负荷。（D） EDA编制的MEF^{重量/重量}、EDA^+/+和EDA^−/−胚胎（13.5d p.c.）被电镀、固定，并与抗EDA抗体（左柱）或抗总FN抗体（中柱）孵育。合并后的图像显示在右列中。

**图3。**
**EDA组织中FN水平的降低** ^+/+ **小鼠与整合素水平的降低无关。**（A和B）所有基因型（EDA）大脑、心脏、肺和肝脏总蛋白提取物（50μg）的Western blot分析^{重量/重量}、EDA^+/+、EDA^−/−、EDA^+/−、EDA^−/重量和EDA^+/重量)使用抗FN多克隆抗体（A）和剥离膜后的抗β-微管蛋白单克隆抗体来验证蛋白质载量的微小误差（B）。请注意，EDA的迁移⁺FN比EDA稍慢⁻FN公司。相同蛋白提取物的5-17%梯度凝胶考马斯兰染色未显示其他蛋白的变化。（C） EDA血浆和血清蛋白样本^+/+、EDA^−/−和EDA^{重量/重量}对小鼠（20μg）进行考马斯蓝染色（左），用类似凝胶进行印迹，并与抗FN抗体孵育（中）。对于抗EDA抗体（右），加载100μg蛋白质提取物。α的（D和E）Western blot分析₉-和β₁-抗α抗体在不同组织（肝、脑和皮肤）中的整合素水平₉和-β₁兔多克隆抗体。使用抗β-微管蛋白单克隆抗体验证蛋白质负荷的微小误差。

**图4。**
**FN在不同年龄段不同组织中的表达。**（A）从EDA中制备肝、心、肺和脑的蛋白质提取物^{重量/重量}、EDA^+/+和EDA^−/−不同年龄的小鼠（13.5 d p.c.、1、3和14个月龄），并使用抗FN抗体进行Western blot分析。（B）直方图表示EDA中FN的相对含量^+/+小鼠相对于EDA中的小鼠^{重量/重量}每个组织和每个时间点的小鼠（视为100%）。

**图5。**
**全层皮肤损伤后5天观察到再上皮化。**对照组全层皮肤伤口（EDA^{重量/重量},n个=6）和突变小鼠（EDA^+/+和EDA^−/−,n个分别为6和7）小鼠在受伤后第5天进行苏木精-伊红染色分析。显示了具有代表性的部分。黑色箭头表示伤口边缘。显示上皮、肉芽组织、真皮、新形成的上皮和焦痂（分别为“e”、“g”、“d”、“re”和“sc”）。顶部面板中的虚线矩形表示底部面板中显示的放大区域。实验重复了两次，结果相似。EDA中观察到水肿肉芽组织^−/−伤口。

**图6。**
**EDA公司** ⁻ ^/ ⁻ **伤后第7天皮肤伤口愈合异常，BrdU阳性细胞增多。**（A）对照组全层皮肤伤口（EDA^{重量/重量},n个=8）和突变小鼠（EDA^+/+和EDA^−/−,n个分别为8和9）小鼠在受伤后第7天进行分析。显示了具有代表性的部分。黑色箭头表示伤口边缘。缩写如图5所示。EDA中观察到的溃疡上皮^−/−伤口标记为“ue”。实验重复三次，结果相似。在受伤后第7天，对三个独立实验（每个实验中每个基因型八只小鼠）的伤口切片进行显微镜评分，以确定是否存在溃疡过程。EDA溃疡创面的比例^−/−小鼠与EDA小鼠的差异具有统计学意义^{重量/重量}和EDA^+/+小鼠（EDA为63%和22%^−/−和EDA^{重量/重量}分别为；EDA的P<0.0002^−/−与EDA对比^{重量/重量}Fisher精确检验和χ²测试）。EDA之间没有差异^{重量/重量}和EDA^+/+分数）。（B） BrdU标记显示EDA中复制细胞数量增加^−/−伤口。用抗BrdU单克隆抗体孵育A中相同伤口的连续切片。几个显微镜视野的计数显示，EDA中新形成的表皮下区域有至少10倍多的BrdU阳性核^−/−与EDA相比，伤口^{重量/重量}或EDA^+/+伤口。显示了一个具有代表性的字段。在EDA中观察到50多个阳性细胞核^−/−伤口（右下角），而在EDA病例中观察到少于五个阳性细胞核^{重量/重量}或EDA^+/+样本（分别位于左下角和中间）。BrdU标记的细胞核用白色三角形表示。黑色箭头表示伤口边缘。

**图7。**
**EDA外显子缺乏选择性剪接会缩短突变小鼠的寿命。**两个EDA^+/+和EDA^−/−在30个月的分析期间，小鼠的寿命缩短。图中显示了39、45和53 EDA生存率与时间的Kaplan-Meier表示^{重量/重量}、EDA^+/+和EDA^−/−在整个研究过程中，分别将小鼠关在单独的笼子里。使用对数秩检验和EDA分析结果^+/+和EDA^−/−与EDA相比，曲线具有统计学意义^{重量/重量}小鼠（用星号表示，P≤0.0005）。

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