Computational identification of Drosophila microRNA genes

doi:10.1186/gb-2003-4-7-r42

.2003;4（7）：R42。

doi:10.1186/gb-2003-4-7-r42。 Epub 2003年6月30日。

果蝇microRNA基因的计算机鉴定

埃里克·C·莱¹, 帕维尔·托曼卡, 罗伯特·威廉姆斯, 杰拉尔德·M·鲁宾

附属机构

PMID： 12844358
预防性维修识别码：项目经理193629
DOI（操作界面）： 10.1186/gb-2003-4-7-r42

果蝇微小RNA基因的计算鉴定

埃里克·C·莱等人。基因组生物学. 2003.

.2003;4（7）：R42。

doi:10.1186/gb-2003-4-7-r42。 Epub 2003年6月30日。

作者

埃里克·C·莱¹, 帕维尔·托曼卡, 罗伯特·威廉姆斯, 杰拉尔德·M·鲁宾

附属

¹美国加州大学伯克利分校分子和细胞生物学系霍华德·休斯医学研究所，539生命科学分院，伯克利，CA 94720。lai@ruitfly.org

PMID： 12844358
预防性维修识别码：项目经理193629
DOI（操作界面）： 10.1186/gb-2003-4-7-r42

摘要

背景：MicroRNAs（miRNAs）是21-22个核苷酸非编码RNA的大家族，具有推测的转录后调节活性。大多数miRNAs是通过直接克隆小RNA来鉴定的，这是一种有利于检测大量miRNA的方法。三个观察结果表明，miRNA基因可以通过计算方法进行鉴定。首先，miRNAs通常来源于70-100个具有扩展干环结构的核苷酸的前体转录物。其次，miRNAs通常在相关物种的基因组之间高度保守。第三，miRNAs表现出一种典型的进化分化模式。

结果：我们开发了一种称为“miRseeker”的信息程序，该程序分析了黑腹果蝇和伪暗腹果蝇的完整常染色序列，以寻找采用扩展干环结构的保守序列，并显示已知miRNAs的核苷酸差异特征模式。这一计算程序的敏感性通过在前124个候选基因中存在75%（18/24）先前确定的果蝇miRNAs来证明。总的来说，我们鉴定出48个新的miRNA候选基因，它们在较远的昆虫、线虫或脊椎动物基因组中高度保守。我们验证了总共24个新的miRNA基因的表达，包括在第三个物种中保守的27个候选基因中的20个和11个高分果蝇特异性候选基因中的4个。我们的分析使我们估计果蝇基因组包含大约110个miRNA基因。

结论：我们的计算策略成功地确定了真正的miRNA基因，并表明miRNA占果蝇预测蛋白编码基因的近1%，这一百分比与最近归因于其他后生动物基因组的miRNA的百分比相似。

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数字

图1
miRNA基因是分离的、进化上保守的基因组序列，具有形成扩展的干环结构的能力，如RNA。所示为来自*D.黑腹果蝇*和*D.假遮蔽*，其中守恒程度由峰的高度表示。该特定区域包含本研究中确定的保守序列，该序列采用已知miRNAs的干环结构特征。该序列的表达已通过northern分析（表2）得到证实，随后被确定为哺乳动物的苍蝇直系祖先*mir-184型*大多数保守序列不具备形成扩展干环的能力，如相邻峰序列所采用的褶皱所证明的那样。

图2
保守茎环序列的分类。**（a）**的模式*果蝇属*前miRNA核苷酸差异模式暗示了miRNA进化的典型进展。这个*果蝇属*先前描述的23/24个miRNAs的直系同源序列要么是完全保守的（1类），要么包含一个或多个仅位于环中的不匹配或间隙（2类），或者与非miRNA-编码臂（3类）相比，环中包含相同或更多数量的突变。我们认为这些代表了miRNAs正常进化的连续步骤，因此用箭头连接它们。1-3班的学生被认为是同样优秀的考生，而4-6班的学生则是较差的考生。正如我们预计第3类候选者最终会进化为第6类候选人（折断箭头）一样，这些进化考虑与进化距离相当于*D.黑腹果蝇*和*D.假遮蔽*.（b）let-7说明了miRNAs在其环序列中的优先发散。这个*果蝇属*let-7的直方图包含三个失配和环内一个间隙，而两个臂都是完全保守的。

图4
miRseeker有效选择真正的miRNAs。**（a）**根据螺旋线/自由能得分（白色条）划分的前2996名候选人的分布情况，其中570人通过了随后的守恒滤波器（绿色条）。参考集的21/24名成员得分为16分或更高，其中20人通过了保守性筛选。请注意，这些数字不包括*mir-10*尽管miRseeker得分为18.45，并且通过了保守性过滤器，但它并没有属于对齐的contig，因此没有进行分析。**（b）**排名前124位的miR寻求者候选名单；参考集的成员以绿色突出显示，本研究中新发现的miRNAs以蓝色突出显示，其他三种特异性候选基因以橙色突出显示。绝大多数最优秀的候选人是*真诚地*.

图5
通过northern印迹法对新miRNAs的不同时间和数量表达谱进行分析。三条泳道代表0-24小时胚胎（E）、三龄幼虫和0-1d蛹（L）以及成年雄性（A），并显示了21-24核苷酸范围的杂交带。**（a-g）**在单个阶段或其中两个阶段的组合中优先表达的miR。**（h-j）**在整个开发过程中以统一水平或分级方式表达的miR。**（k）**miR-1用作对照。请注意，显示的斑点暴露时间不同，因此不同miRNAs的相对水平无法直接比较；请参阅表2。

图6
通过northern blot（2R:11128979=miR-137）获得假阴性证据的miRNA示例。在这个例子中，四种昆虫的四个相关序列(*Dm公司*,*D.黑腹滨鹬；Dp公司*,*假盲蝽；银*,*冈比亚锥虫；氨*,*A.梅尔利弗拉*)它们都采用一种系统发育上保守的干环结构。所有四个物种中都有一只手臂被完美保存，我们推测miRNA是从保守序列（橙色）中加工出来的。miRNAs的核苷酸差异模式具有更多相关序列(*深度/深度*和*农业/农业*)在环内和沿着一条手臂显示出大致相等的发散量，而*深度/深度*与*农业/农业*比较显示，环内完全发散（蓝色），沿假定的非miRNA-编码臂的总体发散稍小。我们推断，成熟的miRNA可能在星号突出显示的U残基之一处启动，因为在果蝇发夹环中发现了保守区域的第一个残基，而第二个G残基则不适合作为miRNA的5'残基。使用与保守区互补的探针以及与保守区相同的探针（如果miRNA从另一条链转录）进行Northern分析为阴性。后来才发现该序列与脊椎动物miR-137同源（在第二个突出显示的U处开始）。我们认为其他具有类似特征的昆虫物种中保存的其他未经验证的预测基因是潜在候选基因（另见表1）。

图7
以下示例*果蝇属*miRNA基因簇。在这张图中，前miRNA用矩形表示，成熟miRNA产生的臂被着色。**（a）**最大的miRNA簇之前由Tuschl及其同事确定[10]；我们确定并通过实验验证了这个集群的一个新成员，*mir-286。*发现第二个保守发夹（浅灰色盒子），但未发现其表达。在这个集群中的七个基因中，只有*mir-286型*保存在按蚊（ano）。还请注意，该簇包含两个相关的miRNA基因(*mir-6-1、-2、-3型*和K-box反义基因*mir-5型*，黄色），以及无关的miRNA基因（黑色）。**（b）**第二个快速miRNA基因进化的例子。这个按蚊基因组包含四个成员*mir-2/mir-13*系列，它们都位于单个集群中。相反，果蝇基因组包含该家族的八个成员，位于三条不同染色体上的四个不同基因组位置。**（c）**一组假定的发育调节器。*let-7*和*mir-125型*与遗传特征基因同源*let-7*和*线-4*在里面*秀丽线虫*。类似的基因簇存在于按蚊，尽管*mir-100型*与其他两个数据库相隔千个基数（未显示）。**（d）**miRNA簇的其他示例。注意，与其他显示的簇一样，miRNA簇可以包含相关基因（黄色），但似乎也可能包含无关基因（黑色）。

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