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.2003年6月；111(12):1933-43.
doi:10.1172/JCI17790。

AIP1通过促进ASK1与其抑制剂14-3-3的分离，介导TNF-α诱导的ASK1活化

张荣（音） 1, 何向荣, 刘伟民, 孟璐, 谢长廷, 王敏
附属公司

AIP1通过促进ASK1与其抑制剂14-3-3的分离，介导TNF-α诱导的ASK1活化

张荣（音）等。 临床研究杂志. 2003年6月.

摘要

TNF-α通过将14-3-3与凋亡信号调节激酶1（ASK1）分离，部分激活ASK1。在本研究中，我们鉴定了一种新的Ras GTPase激活蛋白（Ras-GAP）为ASK1相互作用蛋白（AIP1）。AIP1通过N末端C2结构域内富含赖氨酸的簇与ASK1的C末端结构域结合。AIP1通过N端和C端之间的分子内相互作用以封闭形式存在，TNF-α诱导AIP1的去折叠，导致AIP1与ASK1结合。因此，含有C2和GAP结构域的AIP1的N末端与ASK1组成性结合，并促进ASK1中14-3-3的释放。与14-3-3相反，AIP1优先与去磷酸化的ASK1结合。招募的AIP1增强ASK1诱导的JNK激活，并且AIP1的ASK1结合和GAP活性对AIP1强化的ASK1.激活至关重要。此外，TNF诱导的ASK1/JNK激活在AIP1被RNA干扰击倒的细胞中显著减弱。这些数据表明，AIP1通过促进抑制剂14-3-3与ASK1的分离来介导TNF-α诱导的ASK1激活，这是TNF-alpha激活ASK1一种新机制。

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数字

图1
图1
AIP1的C2结构域对于ASK1的结合是至关重要的。(一)AIP1域和表达式结构的示意图。全长AIP1（AIP1-F）包含一个N端（AIP1-N）和一个C端半体（AIP1-C）。AIP1-N由PH、C2和GAP域组成。C端半包含一个富含脯氨酸的序列（PR）和一个亮氨酸拉链基序（LZ）。AIP1-PHC2包含PH和C2结构域。AIP1-PH仅包含PH结构域。AA，氨基酸。(b条)AIP1的C2域对ASK1绑定至关重要。用FLAG标记的AIP1-N、AIP1-C、AIP2-PHC2或AIP1-PH转染BAEC，用抗FLAG的Western blot检测AIP1的表达。AIP1结构域与内源性ASK1的相互作用用抗ASK1免疫沉淀法检测，然后用抗FLAG免疫印迹法检测。免疫沉淀物中ASK1蛋白用抗ASK1免疫印迹法测定。
图2
图2
AIP1 C2结构域内富含赖氨酸的簇对ASK1结合至关重要。(一)AIP1 C2结构域和PKC保守C2结构域的序列比对。粗体中的氨基酸残基是Ca2+-结合位点。AIP1中的K簇加下划线，并突变为A以生成KA1、KA2和KA1/2（两个K簇的突变）。(b条)第二个K簇的突变显著降低ASK1结合。将标记有FLAG的AIP1-N、KA1、KA2或KA1/2的ASK1-ΔN与内皮细胞中的ASK1共转染，用抗ASK1免疫沉淀法检测ASK1与AIP1-N或突变体的相互作用，然后用抗FLAG免疫印迹法检测其相互作用。
图3
图3
TNF-α诱导内皮细胞中AIP1与ASK1的关联。(一)用AIP1-F或AIP1-N转染BAEC，然后用TNF-α处理（10 ng/ml，15分钟）。细胞裂解物用抗ASK1免疫沉淀，免疫沉淀中的ASK1用抗AIP1免疫印迹法测定。(b条)AIP1抗体的特异性。Cocalico Biologicals Inc.用GST–AIP1-PH免疫兔子，制备了抗AIP1的多克隆抗体。用表达FLAG标记的AIP1-F、-N和-C的293T细胞裂解物通过Western blot（1–3道）测定抗AIP1.的特异性。使用抗-FLAG作为对照（4-6车道）。(c（c）)AIP1在培养的内皮细胞中高度表达。通过Western blot和抗AIP1检测来自HUVEC、乳腺癌MCF-7细胞或前列腺癌细胞系LNCaP（每个样本20μg总蛋白）的细胞裂解液中AIP1的表达。(d日)TNF-α诱导AIP1与ASK1的结合，而它从ASK1解离14-3-3。HUVEC要么未经治疗，要么接受TNF-α治疗（10 ng/ml，15分钟）。用抗ASK1免疫沉淀细胞裂解物，然后用抗AIP1或抗14-3-3免疫印迹。(e（电子）)TRAF2诱导AIP1与ASK1的关联。BAEC通过载体控制（VC）或FLAG-tagged TRAF2（TR2）转染。用抗ASK1免疫沉淀法检测TRAF2或AIP1与ASK1的相关性，然后用抗FLAG或抗AIP1免疫印迹法检测其相关性。(（f）)AIP1对TRAF2-ASK1复合物没有影响。用载体控制或AIP1-N转染BAEC，然后进行TNF-α治疗（10 ng/ml）。用抗TRAF2免疫沉淀法和抗ASK1免疫印迹法测定内源性TRAF2-ASK1复合物。免疫沉淀；IB免疫印迹。
图4
图4
TNF-α破坏AIP1的N-末端和C-末端之间的分子内相互作用。(一)AIP1以封闭形式折叠。用AIP1-F和AIP1-C转染BAEC，然后用10 ng/ml TNF-α处理15分钟（+）或不处理（-）。用AIP1的抗AIP1-N或抗AIP1-C免疫沉淀细胞裂解物，然后用抗FLAG免疫印迹。(b条)TNF-α干扰AIP1-C和AIP1-N的相互作用。将AIP1-C-和AIP1-N转染内皮细胞，然后进行TNF-一(+). 免疫印迹法检测AIP1-C和AIP1-N的表达。用抗AIP1-N免疫沉淀细胞裂解物，然后用抗AIP2-C免疫印迹（3–4道）。
图5
图5
EC中AIP1的过度表达从ASK1释放14-3-3。(一)AIP1从ASK1分离14-3-3。用FLAG标记的14-3-3（1μg）表达质粒转染BAEC，转染不同数量的FLAG–AIP1-N DNA（0、0.1、0.25、0.5、0.75和1μg。AIP1和14-3-3与内源性ASK1的相关性通过抗ASK1免疫沉淀法和抗FLAG免疫印迹法测定。免疫沉淀物中的ASK1用抗ASK1蛋白免疫印迹法测定。(b条)AIP1-N不与14-3-3结合。表达AIP1-N的细胞裂解物用于GST-14-3-3下拉分析。免疫印迹法检测结合AIP1-N蛋白。ASK1被用作对照。
图6
图6
AIP1优先与Ser-967的去磷酸化ASK1结合。(一)ASK1中的14-3-3结合位点（pSer-967）对AIP1关联并不重要。AIP1与载体控制ASK1或ASK1-S967A共转染，后者是14-3-3结合缺陷的突变体。AIP1和ASK1的相互作用通过用抗ASK1进行免疫沉淀，然后用抗FLAG进行蛋白质印迹来检测。S/A，ASK1-S967A。(b条)磷酸酶处理增加AIP1-ASK1复合物。将含有ASK1和AIP1-N的细胞裂解物与碱性磷酸酶（10 U PPase/40μg细胞裂解物）在室温下培养1小时。处理后的裂解产物通过抗ASK1的IP进行处理，然后通过抗FLAG的Western blot进行处理。GST–14-3-3下拉试验被用作磷酸酶治疗的对照。用抗FLAG的蛋白质印迹法检测结合的ASK1。(c（c）)肽特异性。在存在肽ASK1-S或ASK1-pS（0.3 mM）的情况下，ASK1用于GST-14-3-3下拉分析。Western blot结合抗FLAG检测结合ASK1。(d日)AIP1-ASK1相互作用的肽竞争分析。含有ASK1和AIP1-N的细胞裂解物用于免疫沉淀分析，如一在存在肽ASK1-S或ASK1-pS（0.3 mM）的情况下。AIP1和ASK1的相互作用通过用抗ASK1进行免疫沉淀，然后用抗FLAG进行蛋白质印迹来检测。
图7
图7
AIP1增强TNF-α诱导的ASK1活性。(一和b条)AIP1增强TNF-α诱导的ASK1和JNK活化。BAEC通过载体控制（–）或AIP1构建物（AIP1-F、-N或-C）转染。细胞裂解物用于通过抗FLAG的Western blot测定蛋白质表达(一)ASK1和JNK活化通过体外激酶分析测定(b条). 每条车道下方显示了相对的ASK1和JNK活动（将TNF-α处理的病媒控制设置为1.0）。(c（c）)AIP1增强ASK1诱导的EC凋亡。在没有或存在ASK1的情况下，用载体控制（–）或AIP1构建物（AIP1-F、AIP1-N和AIP1-C）转染BAEC。转染48小时后，用DAPI对细胞进行染色，并在荧光显微镜下计数细胞核断裂的凋亡细胞。显示凋亡率。所提供的数据是三个独立实验的平均值。不适用，AIP1-N+AIP1-C(d日)AIP1抑制TNF-α诱导的ERK激活。用AIP1构建物转染内皮细胞，然后进行TNF-α刺激（10 ng/ml，15分钟）。用磷酸化-ERK抗体进行Western blot检测ERK激活。用抗ERK蛋白免疫印迹法测定总ERK。另外两个独立实验也得到了类似的结果。(e（电子）)AIP1增强的ASK1激活需要ASK1结合和AIP1的GAP活性。AIP1构建物在HA-tagged ASK1存在的情况下转染BAEC。蛋白表达通过Western blot和抗HA（针对ASK1）或抗FLAG（针对AIP1）测定。ASK1诱导的JNK活性测定如b条。所示数据代表了三个类似实验。
图8
图8
AIP1在TNF-α诱导的ASK1-JNK激活中的生理作用。(一)AIP1 shRNA表达的核糖核酸酶保护试验。PAGE检测到受保护的SiRNA AIP1探针（～29个核苷酸）并显示。使用来自pShag的RNA作为对照。(b条)表达AIP1 shRNA击倒AIP1蛋白表达。使用稳定转染HeLa克隆（pShag、pShag–AIP1-A或pShag-AIP-B）的总细胞裂解物通过免疫印迹法测定AIP1的表达。ASK1表达作为对照。(c（c）)TNF-α诱导的ASK1和JNK激活在pShag-AIP1细胞中减弱。转染pShag或pShag-AIP1的稳定混合HeLa细胞未经处理或用TNF-α处理（10 ng/ml，15分钟）。ASK1和JNK活性通过所述的体外激酶测定。显示了相对ASK1和JNK活性，TNF-α处理的pShag转染细胞的活性为1.0。从另外两个实验中获得了类似的结果。(d日)提出了TNF-α诱导的ASK1-JNK信号中AIP1功能的模型。AIP1通过N端和C端之间的分子内相互作用以闭合形式折叠。促炎介质（例如TNF-α）破坏AIP1的分子内相互作用。TNF-α还通过未识别的磷酸酶诱导ASK1在Ser-967的去磷酸化，导致AIP1的募集和14-3-3的释放。招募的AIP1增强TNF-α诱导的ASK1-JNK信号传导，其中ASK1结合和AIP1的GAP活性都是必需的。
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中的注释

  • AIP1：TNF信号的新参与者。
    Guicciardi ME，Gores GJ公司。 Guicciardi ME等人。 临床投资杂志。2003年6月；111(12):1813-5. doi:10.1172/JCI18911。 临床投资杂志。2003 PMID：12813014 免费PMC文章。 审查。

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