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.2003年6月；14(6):2342-56.
doi:10.1091/mbc.e02-12-0788。 Epub 2003年2月6日。

Mgm1p是一种与动力相关的GTPase，对线粒体外膜的融合至关重要

Hiromi Sesaki先生 1, Sheryl M Southard女士, 迈克尔·P·亚菲, 罗伯特·延森
附属公司

Mgm1p是一种与动力相关的GTPase，对线粒体外膜的融合至关重要

Hiromi Sesaki先生等。 分子生物学细胞. 2003年6月.

摘要

在酿酒酵母中，线粒体融合需要至少两种外膜蛋白，Fzo1p和Ugo1p。我们提供了直接证据，证明动力蛋白相关的Mgm1蛋白也是线粒体融合所必需的。像fzo1和ugo1突变体一样，MGM1基因破坏的细胞包含大量线粒体片段，而不是野生型细胞中的少数长管状细胞器。mgm1突变体中线粒体的碎片可以通过破坏DNM1（线粒体分裂所需的基因）来挽救。在由交配的mgm1突变体形成的合子中，线粒体不会融合和混合其内含物。在Mgm1p的GTPase结构域中引入突变完全阻断线粒体融合。此外，我们发现mgm1突变体不能融合线粒体外膜和内膜。电子显微镜显示，虽然mgm1突变体显示出异常的线粒体内膜嵴，但mgm1 dnm1双突变体恢复了正常的内膜结构。然而，mgm1-dnm1突变体在线粒体融合中仍然存在缺陷，这表明无论线粒体的形态如何，线粒体融合都需要Mgm1p。最后，我们发现Mgm1p、Fzo1p和Ugo1p在线粒体外膜中发生物理相互作用。我们的结果增加了Mgm1p通过与Fzo1p和Ugo1p的相互作用调节线粒体外膜融合的可能性。

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数字

图1。
图1。
中断MGM1型导致线粒体断裂和丢失以Dnm1p依赖的方式表达mtDNA。（A） 野生型（FY833），毫克1Δ（YRJ1383），dnm1Δ（YRJ1289），以及毫克1Δdnm1表达OM45-GFP的Δ（YRJ1398）细胞在SRaf培养基中生长至对数期，用1μg/ml DAPI染色DIC和荧光显微镜观察。N′表示核DNA染色。棒材，3μm。（B） 野生型，毫克1Δ,dnm1Δ和毫克1Δdnm1Δ细胞为在YEPD培养基中生长至对数期。收集细胞并重新悬浮在YEPD介质至外径600共2个。然后将细胞稀释10倍增量；在YEPD和YEPGE培养基上发现每种稀释液10μl然后在30°C下培养2 d（YEPD）和6 d（YEPGE）。
图2。
图2。
线粒体融合缺陷毫克1Δ和毫克1Δdnm1Δ单元。材料一个细胞用表达IM靶向青色荧光的质粒pHS70转化蛋白质（YTA10-CFP）加仑1发起人。材料用质粒pHS71转化α细胞，该质粒表达IM靶向黄色荧光蛋白（YTA10-YFP）加仑1发起人。细胞在SGalSuc培养基中生长至对数期，隔夜诱导融合蛋白的表达。材料a和α细胞在YEPD培养基上交配3-3.5小时，抑制进一步融合蛋白表达式。YTA10-CFP和YTA10-YFP在代表中的分布图中显示了含有中间芽的合子。通过交配形成的合子野生型细胞（FY833和FY834），毫克1Δ突变体（YRJ1383和YRJ1384），dnm1Δ突变体（YRJ1289和YRJ1290），毫克1Δdnm1Δ突变体（YRJ1398和YRJ1493），以及毫克1Δdnm1W303菌株（YRJ1554和YRJ1555）通过DIC和荧光显微镜检查。部分YFP和CFP之间的重叠见毫克1Δdnm1Δ合子，因为在相同的焦平面。棒材，3μm。
图3。
图3。
Mgm1p的GTPase结构域突变阻碍线粒体融合。（A）野生型和突变型Mgm1p在线粒体中的表达。从野生型（YRJ1556）和突变细胞（YRK1558，YRJ1560和YRJ156/2），并用抗体进行免疫印迹分析Mgm1p和OM45p。箭头和箭头表示100和90kDa形式的分别为Mgm1p。（B） 线粒体融合缺陷毫克1GTPase突变体。材料携带质粒pGAL-YTA10-CFP（pHS70）的细胞和材料携带质粒pGAL1-YTA10-YFP（pHS71）的α细胞在SGalSuc培养基中生长至对数期过夜，以诱导融合蛋白。材料a细胞和α细胞交配3～3.5小时在YEPD培养基上。YTA10-CFP和YTA10-YFP在代表中的分布图中显示了含有中间芽的合子。通过交配形成的合子MGM1 dnm1Δ电池（YRJ1556和YRJ15507），毫克1K223A公路dnm1Δ突变体（YRJ1558和YRJ1559），毫克1S224N型dnm1Δ突变体（YRJ1560和YRJ156/1），以及毫克1T244A型dnm1Δ突变体（YRJ1562和YRJ156/3）为通过DIC和荧光（FL）显微镜检查。棒材，3μm。
图4。
图4。
线粒体OM融合缺陷毫克1Δ,毫克1Δdnm1Δ,fzo1型Δdnm1Δ和乌戈1Δdnm1Δ单元。材料将含有质粒pGAL1-YTA10-CFP（pHS70）的细胞培养成在SGalSuc培养基中对数期过夜诱导IM靶向表达YTA10-CFP公司。材料含有质粒pGAL1-TOM72-YFP的α细胞（pHS72）在SRaf培养基中生长至对数相过夜，然后转移在SGalSuc培养基中培养2 h，诱导OM靶向TOM72-YFP的表达。材料a细胞和α细胞在YEPD培养基上交配3-3.5小时。YTA10-CFP和TOM72-YFP在典型合子中的分布图中显示包含中间芽。野生型交配形成的合子细胞（FY833和FY834），毫克1Δ突变体（YRJ1383和YRJ13804），dnm1Δ突变体（YRJ1289和YRJ1290），毫克1Δdnm1Δ突变体（YRJ1398和YRJ1493），fzo1型Δdnm1型Δ突变体（YRJ1347和YRJ13408），以及乌戈1Δdnm1Δ突变体（YRJ1291和YRJ12902）通过DIC和荧光显微镜。棒，3μm。
图5。
图5。
线粒体IM的结构在毫克1Δ细胞，但在中是正常的毫克1Δdnm1Δ单元。（a）野生型（FY833），（b）ρ0野生型（YRJ1287），（c–e）毫克1Δ（YRJ1383），（f）dnm1Δ（YRJ1289）和（g）毫克1Δdnm1Δ（YRJ1398）电池在YEPRaf培养基中生长到对数相并固定，薄片用电子显微镜检查。箭头和N′表示线粒体和原子核。棒材，0.5μm。
图6。
图6。
mmm1Δ和atp21（atp21）Δ突变体通常融合线粒体。材料含有质粒pGAL-YTA10-CFP（pHS70）的细胞，以及材料将携带质粒pYTA10-YFP（pHS71）的α细胞培养成在SGalSuc培养基中对数相过夜以诱导融合表达蛋白质。材料a细胞和α细胞在YEPD上交配3-3.5小时中等。YTA10-CFP和YTA10-YFP在典型合子中的分布图中显示包含中间芽。野生型交配形成的合子单元格（FY833和FY834），毫米1Δ突变体（YRJ1356和YRJ135），和atp21（atp21）检测Δ突变体（YRJ1564和YRJ156/5）。棒材，3微米。
图7。
图7。
Mgm1p和线粒体OM和IM在膜间空间。（A） Mgm1p是一种外周膜蛋白。线粒体用1.5 M氯化钠处理从野生型细胞（FY833）中分离的细胞，0.1 M碳酸钠，或单独使用缓冲液。那时线粒体膜通过100000离心分离成上清液和颗粒部分×克持续60分钟。通过以下方法分析每个组分的等分样品用Mgm1p、Om45p（一种完整的膜蛋白Tim23p（一种具有单一跨膜结构域的完整膜蛋白四个跨膜结构域），以及F1β（a外周膜蛋白质）。箭头和箭头表示Mgm1p的100和90kDa形式，分别是。（B） Mgm1p位于膜间空间。线粒体，100μg，首先通过渗透性休克（OS）破坏OM完整，然后与50μg/ml胰蛋白酶或50μg/ml蛋白酶K一起孵育在冰上放置20分钟。用抗体免疫印迹法分析蛋白质生成Mgm1p、OM蛋白、Tom37p、IM蛋白、Aac2p和基质蛋白质，Mas2p。（C） Mgm1p和线粒体OM和IM都相关。将5–10 mg的线粒体以10 mg/ml的浓度重悬于SEH（20 mMHEPES-KOH，pH 7.4，250 mM蔗糖，0.5 mM EDTA）含蛋白酶抑制剂（1μg/ml抑肽酶、1μg/ml亮氨酸肽、1 mM苯甲基磺酰氟，10μM反式环氧琥珀酰基-L-eucylamido（4-胍基）丁烷，1μg/ml凝乳抑素，1μg/ml胃蛋白酶抑制素A）。稀释至9 vol of 20，扰乱OM后mM HEPES-KOH，pH 7.4，含蛋白酶抑制剂，冰上30分钟，线粒体在设置为5的情况下，使用60型Sonic进行了三次声波测试，持续30秒拆卸器（费希尔，宾夕法尼亚州匹兹堡）。未断裂的线粒体由32000×离心克持续20分钟。上清液是200000×离心克收集膜20分钟小泡。将膜颗粒重新悬浮在200μl的5 mM HEPES-KOH中，pH 7.4，10 mM KCl，加载11 ml不连续蔗糖梯度（40，35.3，30.7，26%蔗糖，在5 mM HEPES-KOH中，pH 7.4，10 mM KCl）。之后142555×离心克在16小时内，分数为用Mgm1p、OM45p和Cox4p公司。
图8。
图8。
Mgm1p、Fzo1p和Ugo1p在物理上相互作用。线粒体从表达pHS77（A）HA-Fzo1p的菌株YRJ1282中分离得到，或菌株YRJ1294，从质粒pHS57（B）表达myc-Ugo1p，和在1%Triton X-100中溶解。提取物经免疫沉淀HA表位或myc表位的抗体。免疫沉淀物（ppt）用HA表位、myc抗体进行免疫印迹分析表位、Mgm1p、OM45p、Tim23p和Fzo1p，与10%的起始值进行比较线粒体提取物（ext）。星号、箭头和箭头表示Fzo1p，Mgm1p的100和90kDa形式。
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参考文献

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