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.2003年6月2日；197(11):1467-76.
doi:10.1084/jem.20030286。

结合CD74启动MIF信号转导

林冷 1, 克里斯汀·梅茨, 燕芳, 景旭, 西马斯·唐纳利, 约翰鲍, 托马斯·德洛赫里, 陈一邦, 罗伯特·米切尔, 理查德·布卡拉
附属公司

通过与CD74结合启动MIF信号转导

林冷等。 实验医学杂志. .

摘要

巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）是最早被描述的细胞因子活性之一，近年来已成为先天性和适应性免疫的重要调节因子。MIF是单核细胞/巨噬细胞的上游激活物，在感染性休克、关节炎和其他炎症条件的发病机制中起着核心作用。该蛋白由一个独特但高度保守的基因编码，X射线晶体学研究表明，MIF定义了一个新的蛋白质折叠和结构超家族。虽然最近的工作已经开始阐明MIF激活的信号转导途径，但其膜受体的性质尚不清楚。通过表达克隆和功能分析，我们在此报告了CD74，一种II型跨膜蛋白，是MIF的高亲和力结合蛋白。MIF与CD74的胞外结构域结合，CD74是MIF诱导激活胞外信号调节激酶1/2 MAP激酶级联、细胞增殖和PGE2生成所必需的。重组可溶性CD74结合MIF，其解离常数约为9 x 10-9 Kd，如表面等离子体共振（BIAcore分析）所定义，可溶性CD74抑制MIF介导的细胞外信号调节激酶在特定细胞系统中的活化。这些数据为MIF与靶细胞的相互作用提供了分子基础，并将其确定为CD74的天然配体，CD74以前参与免疫细胞激活的信号传递和辅助功能。

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数字

图1。
图1。
Alexa-488–改良MIF（Alexa-MIF）显示在已建立的分析中MIF生物活性保持不变。（A） IFN-γ预处理的THP-1单核细胞中p44/p42（ERK-1/2）MAP激酶级联的剂量依赖性激活（25）。（B） 抑制原代人成纤维细胞p53依赖性凋亡（参考文献；CM，完全培养基；SFM，无血清培养基）。以50 ng/ml添加MIF或Alexa-MIF。所示数据为三个重复孔的平均值±SD，代表三个独立实验。（C） 在Alexa-MIF和使用我-多巴色素甲酯作为底物（35）。
图2。
图2。
Alexa-MIF与细胞结合的荧光分析。（A） Alexa-MIF与THP-1单核细胞结合的流式细胞术分析。Alexa MIF结合的竞争是在存在20μg/ml未标记MIF的情况下进行的。（B） 通过共焦显微镜直接观察Alexa-MIF与THP-1单核细胞的结合。用1 ng/ml IFN-γ孵育THP-1细胞72小时，并用Alexa-MIF（左）或Alexa-MIMF加上25倍的未标记rMIF（中）染色。将细胞从4°C转移到37°C 15分钟后，细胞结合的Alexa MIF迅速内化（右）。放大倍数：630。
图3。
图3。
通过表达克隆鉴定CD74作为MIF的细胞表面结合蛋白。（A） 通过荧光激活细胞分选显示MIF结合活性的COS-7细胞转染体进行富集。（B） CD74（35-kD亚型）的结构，以及10个具有MIF结合活性的代表性CD74 cDNA克隆中的3个。IC、TM和EC分别是细胞内、跨膜和细胞外结构域。M1和M17是指替代翻译起始的两个位置（42）。
图4。
图4。
Alexa-MIF与CD74表达细胞结合的荧光分析。（A） 流式细胞术分析Alexa-MIF与CD74转染与对照载体转染的COS-7细胞（左）的结合，以及Alexa-MIF与抗CD74单克隆抗体（克隆LN2）孵育的CD74转导的COS-70细胞（右，con-Ab）的结合。抗CD74单克隆抗体LN2与蛋白质胞外COOH末端60个氨基酸内的表位发生反应（48）。以50μg/ml添加单克隆抗体，所示数据代表至少三个独立实验。（B） 用Alexa-MIF（左）和罗丹明标记的抗CD74单克隆抗体（中）双重染色的代表性THP-1细胞（IFN-γ-预处理）的共焦显微镜图像。带有黄色区域的合并图像表示MIF和CD74（右）的共定位。共定位百分比计算为69.2±12.0（P=0.0308，n个=6个单元格）。
图5。
图5。
MIF与CD74结合的生化证据。（A） CD74下拉框检测到细胞表达的CD74结合MIF。截短膜CD74（V5-CD741–72)，全长（V5-CD741–232)和NH2-终端截断CD74（V5-CD7446–232)cDNA在pcDNA3.1/V5-HisTOPO表达载体中表达，转染COS-7细胞，蛋白产物通过其表达的His标签沉淀。用抗V5蛋白免疫印迹法监测CD74的表达和恢复情况（top）。免疫印迹法检测MIF（底部）。载体：用空载体对照转染的细胞。（B） MIF在体外与CD74的胞外结构域结合。35使用所示的不同CD74表达质粒在偶联转录和翻译反应中制备S-CD74蛋白。通过测量预涂MIF的96孔板中的结合放射性来评估蛋白质-蛋白质的相互作用(n个=每次实验6口井）。所显示的数据代表了三个实验。（C） 可溶性胞外区CD74（sCD7473–232)但不是截短膜的CD74（sCD741–72)通过夹心ELISA抑制MIF检测。固定化抗MIF单克隆抗体捕获了MIF浓度的增加，随后添加了所示的sCD74种和生物素化抗MIF-pAb（43）。用链霉亲和素结合碱性磷酸酶和第页-以硝基苯磷酸盐为底物。
图6。
图6。
通过实时表面等离子共振（BIAcore分析）测量MIF与CD74的高亲和力结合。sCD74（sCD74）之间相互作用的代表性生物传感器73–232)和MIF传感器芯片，如材料和方法（顶部）所述。MIF与膜相关G蛋白βγ相互作用的控制（底部）。
图7。
图7。
CD74介导MIF刺激p44/p42（ERK-1/2）磷酸化和PGE2野生型而非CD74-KO巨噬细胞的产生。硫代乙醇酸合法的腹腔巨噬细胞来自CD74+/+和CD74−/−小鼠和6×105用指示浓度的MIF刺激细胞2.5小时。收集细胞，并使用材料和方法中所述的特定抗体对裂解产物进行磷酸化p44/p42和总p44/p43的定量。上清液PGE2用ELISA（10）测定浓度。所示数据代表三个独立实验。
图8。
图8。
CD74介导MIF刺激ERK-1/2（p44/p42）磷酸化和人类Raji B细胞增殖。（A） MIF启动ERK-1/2磷酸化和（B）sCD7473–232和抗CD74mAb抑制MIF诱导的Raji细胞中ERK-1/2磷酸化。在不相关蛋白（BSA）、膜截断CD74（sCD74）的存在下，用50 ng/ml MIF刺激Raji细胞2.5小时1–72)，细胞外结构域CD74（sCD7473–232)，一种同种型对照抗体（Con-Ab），或两种抗CD74单克隆抗体（克隆M-B741或LN2，每种以50μg/ml添加）。与抗CD74单克隆抗体（未描述）相比，直接作用于无关Raji细胞表面蛋白（63）的抗CD63单克隆抗体也没有阻断MIF刺激的p44/p42磷酸化。（C） 抗CD74单克隆抗体抑制MIF诱导的Raji细胞增殖。按照材料和方法中的描述培养Raji细胞，并在50μg/ml所示抗体的存在下用rMIF刺激。在没有添加MIF的情况下，抗CD74抗体对Raji细胞增殖没有影响（未描述）。
图9。
图9。
CD74介导MIF对CCL210人肺成纤维细胞ERK-1/2（p44/p42）磷酸化和增殖的刺激。（A） MIF刺激ERK-1/2（p44/p42）磷酸化，（B）抗CD74单克隆抗体抑制CCL210人肺成纤维细胞ERK-1/2磷酸化和增殖。在存在同型对照抗体（Con-Ab）或抗CD74单克隆抗体（克隆LN2）的情况下，用50 ng/ml MIF刺激成纤维细胞2.5小时。（C） 抗CD74抑制MIF诱导的人成纤维细胞增殖。在Con Ab或抗CD74 mAb（克隆LN2）存在的情况下，用50 ng/ml rMIF刺激细胞2.5小时，每种浓度为100μg/ml。增殖结果是三次试验的平均值±SD，至少代表三次单独试验。在没有添加MIF的情况下，抗CD74抗体对肺成纤维细胞的增殖没有影响（未描述）。
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