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.2003年6月；77(12):6913-22.
doi:10.1128/jvi.77.12.6913-6922.2003。

新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶二聚体界面突变导致的融合缺陷是由于受体结合的温度依赖性缺陷所致

伊丽莎白·A·科里 1, 安妮·米尔扎, 伊丽莎白·列万多夫斯基, 罗纳德·米奥里奥
附属公司

新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶二聚体界面突变导致的融合缺陷是由于受体结合的温度依赖性缺陷所致

伊丽莎白·A·科里等。 J维罗尔. 2003年6月.

摘要

四聚副粘病毒血凝素-神经氨酸酶（HN）蛋白通过其神经氨酸蛋白酶（NA）活性介导对唾液酸受体的粘附以及同一部分的裂解。新城疫病毒（NDV）HN二聚体的X射线晶体结构表明，两种不同构象中的一个位点介导了这两种活性。这种构象变化预计涉及每个HN二聚体中单体之间结合的改变，并且是HN结构中一系列变化的一部分，这些变化将HN对受体的识别与另一种病毒表面糖蛋白（融合蛋白）的激活联系在一起。为了探讨二聚体界面对HN功能的重要性，我们对球状头部二聚体接口最靠近膜部分由残基218至226定义的结构域中的残基进行了定点突变分析。该结构域中携带F220、S222和L224残基替代物的蛋白质缺乏融合。然而，这种融合缺陷并不是由于突变对融合的直接影响。相反，融合缺陷是由于在37摄氏度下介导受体识别的能力严重受损，这种表型不能归因于NA活性的变化。由于这些突变蛋白中的每一个在寒冷中都能有效地介导附着，这也不是由于突变蛋白固有的无法识别受体。相反，界面突变通过减弱HN与其受体之间的相互作用发挥作用。这些突变体的表型与单体间亚单位相互作用的破坏有关。

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数字

图1。
图1。
HN二聚体中单体之间的界面域。本研究中的突变靶域显示为L-Kansas分离物HN二聚体pH 6.5形式的X射线晶体结构主干中的填空模式。由残基218至226定义的结构域从侧视图（a）和膜视图（B）中显示。不同单体上的残留物以填空模式显示为红色或黄色。作为参考，每个二聚体中的残基124，即蛋白质可溶性形式中最具N末端残基的残基，推测位于茎顶部附近，也显示为深蓝色的填空模式。该图形是使用RasMol生成的。
图2。
图2。
HN界面突变体的细胞表面表达和抗原完整性。HN界面突变体的细胞表面表达通过荧光激活细胞分选分析进行定量，其中至少有五种单克隆抗体对蛋白质球状结构域上的不同抗原位点具有特异性。所示结果代表至少三次测定的平均值。wt，野生型。
图3。
图3。
HN界面突变体的融合促进活性。对携带所示氨基酸替换的HN蛋白进行检测，以确定其在促进融合中补充F蛋白的能力。每个值是至少五次测定的平均值。wt，野生型。
图4。
图4。
HN界面突变体和F蛋白共存的单层中的合胞体形成。合胞体形成的程度显示为单层，与野生型F共存：（A）载体控制；（B） 野生型HN；（C） F220A HN；（D） F220N海南；（E） S222T HN；转染后22h，用甲醇固定单层，Giemsa染色。小合胞体在表达F220A的单层中用箭头（C）表示。
图5：。
图5：。
HN界面突变体的血液吸附（HAd）活性。HN界面突变体对血黏性豚鼠红细胞的能力通过在4°C或37°C下培养30分钟来测定。减去仅表达载体的单层获得的背景水平，数据表示为野生型（wt）HN表达单层获得的量的百分比。所示数据表示至少四次测定的平均值。
图6。
图6。
37°C和4°C时血液吸附活性的比率。利用图5中的数据，计算37°C时野生型HN血液吸附（HAd）与4°C时的比率。
图7。
图7。
HN界面突变体和野生型HN从4°C转变为37°C后的血液吸附活性。将红细胞在表达野生型（wt）HN或F220N、F220Y、S222K、L224Q或L224S HN的冷到单层中吸附30分钟。在清洗之前，立即用含钙和镁的冷磷酸盐缓冲盐水清洗平板，或将平板移至37°C下10、20或30分钟。如前所述，用分光光度法定量血液吸附（HAd）活性。每一点表示未转移到更高温度的对照板上残留的血液吸附百分比，代表两次测定的平均值。
图8。
图8。
HN界面突变体的NA活性。在转染后22小时，通过测定每种突变体从神经氨乳糖中切割唾液酸的能力来测定每种突变体的NA活性。数据表示至少三次测定的平均值，针对细胞表面表达的差异进行了校正（图2），并表示为野生型HN NA活性的百分比。
图9。
图9。
暴露于表达界面突变体的单层的红细胞可以重新附着。将2%的红细胞悬浮液暴露于表达野生型（wt）HN或F220N、S222A或L224S突变蛋白的单层中，在37°C下持续1h，并频繁搅拌。去除红细胞并调节至2.5×10的浓度7细胞/ml。将1毫升这种悬浮液添加到表达野生型HN蛋白的新单层中，并在4°C培养30分钟后测定血液吸附（HAd）。数据以第一轮暴露于野生型HN表达单层的红细胞获得的血液吸附百分比表示，并表示至少四次测定的平均值。
图10。
图10。
HN二聚体中单体之间界面的膜近端区域。在本研究中，针对二聚体中的两个单体显示了诱变的结构域。膜视图显示了两个域的反平行方向。氢键用虚线表示。该图是用瑞士PDB Viewer（葛兰素史克威康实验研究）从L-Kansas NDV分离物的HN的pH 6.5结构生成的。注意，残基219是NDV-L HN中的异亮氨酸，是NDV-AV HN的缬氨酸。
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