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.2003年5月15日；23(10):4054-65.
doi:10.1523/JNEUROSCI.23-10-04054.2003。

点亮感官：FM1-43通过非选择性离子通道加载感官细胞

杰森·梅耶斯 1, 理查德·麦克唐纳, 安妮·达根, 大卫·伦齐, 大卫·G·斯坦达尔特, 杰弗里·T·科尔文, 大卫·P·科里
附属公司

点亮感官：FM1-43通过非选择性离子通道加载感官细胞

杰森·梅耶斯等。 神经科学. .

摘要

我们描述了一种重要荧光染料进入感觉细胞和神经元的新机制：通过离子通道渗透。除了通过内吞作用缓慢地吸收苯乙烯基染料外，小型苯乙烯基染料如FM1-43通过开放的机械转导通道进入内耳，快速而特异地标记毛细胞。这种标记可以通过药物或机械关闭通道来阻断。这种现象并不局限于毛细胞转导通道，因为表达香草酸受体（TRPV1）或嘌呤能受体（P2X2）的人胚胎肾293T细胞在这些受体通道打开时，而不是在药物阻断时，会迅速吸收FM1-43。这种通道渗透机制也可用于标记体内多种感觉细胞类型。将FM1-43（3毫克/千克体重）单次皮下注射到小鼠体内，即可在头神经节和背根神经节内的毛细胞、默克尔细胞、肌梭、味蕾、肠神经元和初级感觉神经元上形成鲜明的标记，持续数周。标签的样式是特定的；非感觉细胞和神经元保持未标记状态。感觉神经元的标记需要染料通过感觉终端进入，这与通过感觉通道的渗透一致。这表明有机阳离子染料能够通过许多不同的感官通道。苯乙烯染料的明亮而特异的标记为在体内和体外研究感觉细胞和神经元提供了一种新的方法，并为视觉检测感觉通道功能提供了新的机会。

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数字

图1。
图1。
FM1-43迅速充满听觉和前庭毛细胞的细胞质，从细胞顶部进入并向细胞底部推进。A、，小鼠耳蜗外毛细胞FM1-43标记的共聚焦时间序列。染料在60秒内扩散到电池中。标签从发束开始，可以看到三排发束（箭头）。然后，荧光从上到下充满外毛细胞（OHC）的细胞质，但被排除在细胞核之外(N个). 图中显示了第一排OHC中的四个细胞体。B、，FM1-43之前小鼠心室毛细胞FM1-43标记时间序列的共焦图像(一)，在FM1-43脉冲期间(b)，以及在去库存期间(c（c）). 培养基（1）、发束（2）、细胞顶点（3）和细胞基底（4）中荧光定量区域C类显示。C、，FM1-43的两个脉冲期间显示的区域内荧光强度的时间进程。顶部（1）是介质的荧光（扩展垂直轴），用于指示FM1-43脉冲的计时。显微照片的次数B类显示。在FM1-43应用期间，束中的荧光信号迅速饱和（2）；洗脱后，束信号减弱，顶端（3）、基部（4）细胞质出现荧光。D、，如果FM1-43在发束质膜内外分裂，并通过静纤毛尖端进入并扩散到细胞质中，则会出现荧光模型；区域，如中所示C类（见材料和方法）。E、，通过将囊状物倒置并密封在盖玻片上，将染料从毛细胞顶端表面排除的示意图。F中，球囊顶部表面的荧光显微照片电子孵育10分钟。质膜有标记，但细胞质没有标记。G、，一只青蛙球囊的荧光显微照片从盖玻片上揭开并孵育5分钟，显示毛细胞被FM1-43正常标记。
图2。
图2。
FM1-43通过非内皮细胞途径快速进入毛细胞。A、，FM1-43和FM3-25的填充模型。B、，22°C下涂抹FM3-25 15分钟后的毛细胞共焦切片；角质板正下方的焦平面。质膜被标记，但细胞质中未观察到染色。C、，22°C下涂抹FM1-43 5分钟后的毛细胞。细胞质被明亮地标记。D、，在22°C下使用FM3-25 60分钟后。细胞质中有荧光。E、，在4°C下涂抹FM1-43 5分钟后。标签与室温下的标签相似，但亮度较低。F中，在4°C下使用FM3-25 60分钟后。细胞质标记被阻断。插入，位于细胞顶部表面的焦点平面。明亮的标记局限于角质板周围的一个环，角质板是顶端内吞作用的部位。
图3。
图3。
FM1-43通过其毛束进入牛蛙毛细胞。A、，在顶端表面的水平上标记鬼笔肽的共聚焦图像。用硝酸纤维素条沾污后，一排毛细胞失去了束（箭头），尽管它们的角质板仍然完好无损（较薄的圆盘）。B、，FM1-43标签的共焦图像，位于角质板下方。C、，的彩色叠加A类和B类缺少束的毛细胞比有束的相邻细胞的FM1-43标记要少得多。D–I，时间序列中的一系列图像，在此期间，FM1-43以窄流聚焦于发束尖端，实验安排为J·E，流出移液管降低，使水流刚好掠过最高的静纤毛。F中，水流进一步降低，以接触管束顶部。角质板下方的细胞质出现荧光。G、，束上方升起的流。包裹开始脱落。H、，束完全脱色，但荧光保留在细胞质中。我，溪流下降，以吃草最高的静纤毛。只有最高的静纤毛变成了荧光，显示了染料流的范围。J中，流出和流入吸管示意图。显示了束（红色）和顶端细胞体（蓝色）内荧光定量区域。K、，在束（红色）和细胞体（蓝色）中施用FM1-43期间和之后的荧光定量，以及图像的时间D–I型表明。
图4。
图4。
FM1-43可以通过机械传导通道进入毛细胞。A、，FM1-43中培养的青蛙囊状毛细胞的正常负载。B、，在1米内培养毛细胞米Gd公司三+FM1-43装载之前和期间。插入，的区域B类增强显示质膜的微弱标记。Gd公司三+阻止FM1-43的内部化。C、，Gd的量化三+FM1-43加载块和Gd后恢复加载三+冲刷，通过去极化将负载降低至约−25 mV，45 m米外部K+，预处理5mM（M）BAPTA切割尖端链环（平均值±SEM）。D、，在不添加Ca的盐水中，FM1-43负载到青蛙囊状毛细胞中的定量2+0.1、1.0或10米M（M）钙2+。入口仅显著减少了10米米钙2+（平均值±SEM）。E、，用于打开或关闭转导通道的刺激的示意图。由于纹状体处的束方向发生变化，瞄准黄斑的液体喷射关闭了纹状体左侧毛细胞的转导通道，打开了右侧的通道。F中，将FM1-43之后的青蛙球囊用流体射流吹过球囊2分钟。球囊和移液管的轮廓为白色，条纹的大致位置为黄色。条纹右侧（正向偏转）染色流中的细胞内化了FM1-43，而左侧（负向）的大多数细胞没有内化。G、，中装箱区域的DIC视图G公司在发束的平面上。箭头表示68根发束的方向；一条黄线划定了条纹。左边的三个毛细胞被圈出，它们的束朝向右边。H、，现场荧光显微照片H（H）在细胞体的水平上测量。被负向推束的毛细胞保持未标记状态，而被正向推束毛细胞则被明亮地标记为FM1-43。
图5。
图5。
FM1-43通过辣椒素受体通道TRPV1和ATP受体通道P2X渗透2.A、，转染TRPV1并暴露于辣椒素（0.5μ米)带FM1-43（10μ米)持续3分钟。B、，模拟转染细胞暴露于辣椒素和FM1-43。C、，TRPV1转染的HEK细胞暴露于47°C的FM1-43中3分钟。D、，TRPV1转染的HEK细胞暴露于辣椒素和FM1-43以及TRPV1拮抗剂钌红（10μ米).E、，P2X转染HEK细胞2暴露于20μ米10μATP米FM1-43持续3分钟。F中，第二页2-转染HEK细胞暴露于ATP和FM1-43以及P2X拮抗剂PPADS（100μ米). 除非另有说明，实验均在室温下进行。
图6。
图6。
可固定的FM1-43类似物AM1-43在幼年小鼠皮下注射后标记许多感觉结构。A–C，放大倍率增加时的耳蜗毛细胞。内外毛细胞都有明亮的标记，但耳蜗中的其他细胞没有。D、，椭圆囊黄斑中的毛细胞。E、，注射新生小鼠头部的外部。所有的毛囊，从鼻子到尾巴，都被标记，而触须毛囊的标记最为强烈。F中，单个触须毛囊的顶端半部分。标记了默克尔细胞和支配默克尔细胞的纤维。G、，默克尔细胞位于背部皮肤表面下方的触摸穹顶内。H、，解剖肌肉内纺锤形器官中的螺旋纤维。我，眼睛，显示角膜伤害性纤维的标记。J中，鼻上皮的伤害性纤维。K、，肾横切面，皮质标记。L、，软腭内的神经末梢。M之间，在硬腭的geschmackstreifen中标记。N、，舌头上，个别味蕾上有明亮的标签。O、，舌中的真菌状乳头。控制味蕾的纤维被标记，但味觉受体细胞没有被标记。P、，舌中的周乳头。味觉受体细胞本身被标记。
图7。
图7。
AM1-43标记幼年小鼠全身注射后的初级感觉神经元。A、，P15小鼠的大脑和脊髓起始段，在死亡前24小时注射。标签指示标记的感觉神经节的位置。底视图；左侧为吻侧。B、，脊髓背根神经节FM1-43标记；俯视图。C、，单个背根神经节内神经元的标记；共聚焦截面。大多数神经元都积累了染料，但有些神经元的荧光比其他神经元更明亮。D、，注射小鼠大脑的矢状面；从嘴到右。在大脑中，唯一标记鲜明的神经元是三叉神经系膜-丘脑核（MesV，箭头）的神经元，位于小脑的嘴侧和腹侧（Ce）。脉络丛（CP）的荧光较淡，大脑内的所有血管都有微弱的荧光。E、，大脑冠状切片中MesV的标记神经元。插入，MesV中的单个神经元，其胞体和进程标记为FM1-43；标签遍布细胞质。
图8。
图8。
AM1-43标记感觉神经元需要在感觉末梢染色。A、，将染料注入单个滤泡24小时后，胡须滤泡（箭头）中的AM1-43荧光。B、，三叉神经节位于注射卵泡的同侧。神经节鼻部（顶部）的神经元亚群用AM1-43标记。C、，皮下注射AM1-43 24小时后三叉神经节的荧光；共聚焦截面。D、，结扎同侧三叉神经眶下支之前皮下注射AM1-43 24小时后对侧三叉神经节荧光。E、 F中，控制和结扎三叉神经节的整体视图。结扎阻断标记鼻神经支配面部(F类，顶部），但不是后部神经元（底部）。G、 H、，皮下注射AM1-43 48小时后和单侧结扎眶下神经24小时后，整个三叉神经节的荧光。无门控和结扎神经节内的大多数神经元都有标记。
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