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。2002年11月至12月；38(10):582-94.
doi:10.1290/1543-706x（2002）38<582:ncimat>2.0.co；2

通过电子同源性分析、酵母中的相互作用克隆和培养细胞中的共定位推导出的整合线粒体和微管细胞骨架与染色体重塑和肿瘤抑制因子RASSF1的新型复合物

刘乐元 1, 沃·艾米, 刘国钦, 华莱士·L·麦基汉
附属公司

通过电子同源性分析、酵母中的相互作用克隆和培养细胞中的共定位推导出的整合线粒体和微管细胞骨架与染色体重塑和肿瘤抑制因子RASSF1的新型复合物

刘乐源等。 体外细胞开发生物动画。 2002年11月至12月。

摘要

人类基因组完整序列的可用性和序列同源性分析加速了新的蛋白质发现和蛋白质功能线索。蛋白质-蛋白质相互作用克隆提示了多亚单位复合物和途径。在此，我们将这些分子方法与培养细胞共定位分析相结合，提出了一种新的复合物和途径，将线粒体位置和微管细胞骨架与染色体重塑、凋亡、，以及基于与成纤维细胞生长因子受体复合物共纯化的新型富含亮氨酸的五肽重复运动蛋白（LRPPRC）的肿瘤抑制。经过一轮相互作用克隆和序列同源性分析，确定了一个主要的LRPPRC复合物，该复合物具有新的亚单位猫眼综合征染色体区域候选2（CECR2）、普遍表达的转录物（UXT）和染色体19开放阅读框5（C19ORF5），但其功能尚不清楚。免疫、脱氧核糖核酸（DNA）和绿色荧光蛋白（GFP）标记共定位分析表明，LRPPRC出现在培养细胞的胞浆和细胞核中，与线粒体和β-微管蛋白共定位，而不是与间期细胞胞浆中的α-肌动蛋白共定位，在有丝分裂细胞中，围绕分离染色体显示出相依赖性组织。GFP标记的CECR2B严格为细胞核，并与凋亡细胞中的浓缩DNA共定位。GFP标记的UXT和GFP-标记的C19ORF5出现在细胞质和细胞核中，并与LRPPRC和β-微管蛋白共定位。显示核C19ORF5的细胞发生凋亡。在人类肝脏互补DNA文库中筛选与主要LRPPRC底物相互作用的底物，发现CECR2B与染色质相关TFIID-相关蛋白TAFII30和核糖核酸剪接因子SRP40相互作用，UXT桥接CBP/p300结合因子CITED2和动粒相关因子BUB3，C19ORF5与线粒体相关的NADH脱氢酶I和细胞色素c氧化酶I复合。C19ORF也与RASSF1相互作用，为凋亡和肿瘤抑制提供桥梁。

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数字

图1
图1
间期细胞LRPPRC抗原的免疫化学分析。COS7公司(A类–D类)和HepG2(E类)如材料和方法中所述，将细胞培养、固定并与针对LRPPRC产生的小鼠单克隆抗体Mab4C12孵育。用德克萨斯州Red-X标记的山羊抗鼠lgG检测小鼠抗体(红色)，细胞核用DAPI染色(蓝色). 颜色来自左边和中间面板在中合并右侧面板。粉红色表示红色LRPPRC抗体染色与蓝色DAPI DNA染色重叠。左上横杆，10微米。LRPPRC，富含亮氨酸的五肽重复运动-含络合物；DAPI，4,6-二氨基-2-苯基吲哚；脱氧核糖核酸；HepG2，人肝癌细胞。
图2
图2
有丝分裂HepG2细胞中LRPPRC抗原的分析。通过去除血清并随后添加5%的血清4小时，培养群体中有丝分裂HepG2细胞的百分比增加（材料和方法）。抗原LRPPRC(红色)和DNA(绿色)如图1所示进行分析。左上横杆，10微米。LRPPRC，富含亮氨酸的五肽重复运动-含络合物；脱氧核糖核酸；HepG2，人肝癌细胞。
图3
图3
LRPPRC抗原与间期细胞中线粒体的克隆化。HepG2细胞(A类)和COS7(B类)用1μM（M）MitoTracker®红色CM-H2XRo（已分配绿色)在用Mab4C12和FITC-结合的山羊抗鼠IgG抗体（指定红色). COS7细胞用10μM（M）紫杉醇或诺考达唑过夜，如所示。合并的黄色表明LRPPRC抗原和线粒体的共定位。左上横杆，10微米。LRPPRC，富含亮氨酸的五肽重复运动-含络合物；HepG2，人肝癌细胞；异硫氰酸荧光素。
图4
图4
重组GFP标记的LRPPRC、CECR2B、UXT和C19ORF5与天然LRPPRC抗原的克隆化。将编码GFP标记产物的cDNA瞬时转染COS7细胞。如图1所示，用Mab4C12抗体对细胞进行染色。标有GFP的产品如所示绿色和Mab4C12染色抗原红色。橙色和黄色的指示GFP标记的产物和LRPPRC抗原的重叠。左上横杆，10微米。绿色荧光蛋白；LRPPRC，富含亮氨酸的五肽重复运动-含络合物；cDNA，互补脱氧核糖核酸。
图5
图5
GFP–C19ORF5的核浓缩和DNA的解体。短暂转染GFP–C19ORF5 72 h后固定COS7细胞，并用DAPI进行复染。(A类)在一个细胞核中具有浓缩的GFP–C19ORF5的双核细胞。一和b条是以20倍不同灵敏度设置查看的相同字段。(B类)GFP–C19ORF5核浓缩的例子与DNA的崩解一致。示例I、II、III和IV中GFP信号的相对强度分别为1、2、10和20，而DAPI（DNA）信号强度是均匀的。单个绿色GFP和蓝色DAPI荧光表示为白色和合并分别是。左上横杆，10微米。绿色荧光蛋白；脱氧核糖核酸；DAPI，4,6-二氨基-2-苯基吲哚。
图6
图6
浓缩GFP–CECR2B与浓缩DNA的关联。转染GFP–CECR2B后72小时固定COS7细胞(绿色)并用DAPI染色(蓝色). 指出了四个不同的例子，其中浓缩的DNA出现在细胞核不同部位的不同病灶中。青色在中右侧面板表示两个信号的重叠。左上横杆，10微米。绿色荧光蛋白；脱氧核糖核酸；DAPI，4,6-二氨基-2-苯基吲哚。
图7
图7
用β-微管蛋白对GFP标记的LRPPRC、UXT和C19ORF5进行染色。用GFP标记的产物瞬时转染COS7细胞绿色然后用小鼠抗β微管蛋白（克隆TUB2.1）单克隆抗体和山羊德克萨斯红结合抗鼠IgG抗体染色(红色). 细胞核用DAPI染色(蓝色). 颜色已合并到右侧面板，其中黄色的表明GFP标记产物与β-微管蛋白重叠。青色显示核相关绿色GFP与蓝色DAPI染色DNA重叠。左上横杆，10微米。绿色荧光蛋白；LRPPRC，富含亮氨酸的五肽重复运动-含络合物；DAPI，4,6-二氨基-2-苯基吲哚。
图8
图8
GFP标记的LRPPRC、UXT和C19ORF5蛋白与肌动蛋白细胞骨架缺乏共定位。表达相同GFP标记表达产物的细胞(绿色)如图7所示，按照材料和方法所述进行渗透。F-actin用德克萨斯州Red-X标记的卵磷脂染色(红色). 细胞核DNA用DAPI染色(蓝色). 在合并的面板，无显著黄色的表明GFP产物和F-actin缺乏重叠。青色表示GFP和DAPI信号重叠。图像捕获未经过滤，以避免488 nm处的棕色背景干扰。这导致了一些人为因素绿色背景在中左侧面板因此，一些黄色的在中合并面板。左上横杆，10微米。绿色荧光蛋白；LRPPRC，富含亮氨酸的五肽重复运动-含络合物；脱氧核糖核酸；DAPI，4,6-二氨基-2-苯基吲哚。
图9
图9
LRPPRC复合体的潜在特性、相互作用和功能。指出了间期细胞质和细胞核以及有丝分裂中期和后期的潜在相互作用。组件首字母缩写定义见文本、表1和下文。着色组件表示间期细胞中的一个严格的核位置。有丝分裂示意图中描绘了一个分离的姊妹染色单体附着在动粒（K）处的微管（MT）上。TATA-结合转录起始因子亚基TFIID；RNA聚合酶II；CTD，RNA聚合酶I大亚单位的C末端结构域；LRPPRC，富含亮氨酸的五肽重复运动-含复合物。
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