Myocardin is a master regulator of smooth muscle gene expression

doi:10.1073/pnas.1232341100

.2003年6月10日；100(12):7129-34.

doi:10.1073/pnas.1232341100。 Epub 2003年5月19日。

心肌素是平滑肌基因表达的主要调节因子

王志高¹, 王大志, G C Teg管道, 埃里克·N·奥尔森

附属公司

PMID： 12756293
预防性维修识别码：项目经理165841
内政部： 10.1073/pnas.1232341100

肌卡蛋白是平滑肌基因表达的主要调节因子

王志高等。美国国家科学院程序. 2003.

.2003年6月10日；100(12):7129-34.

doi:10.1073/pnas.1232341100。 Epub 2003年5月19日。

作者

王志高¹, 王大志, G C Teg管道, 埃里克·N·奥尔森

附属

¹德克萨斯大学西南医学中心分子生物学系，美国德克萨斯州达拉斯哈里·海恩斯大道6000号，邮编75390-9148。

PMID： 12756293
预防性维修识别码：项目经理165841
内政部： 10.1073/pnas.1232341100

摘要

迄今为止，几乎所有分析的平滑肌基因在其控制区域中都含有两个或多个血清反应因子（SRF）的重要结合位点。因为SRF在广泛的细胞类型中表达，它本身不能解释平滑的肌肉特异性基因表达。我们发现，心肌蛋白是SRF的心肌和平滑肌特异性转录辅激活子，通过与SRF的关联，可以激活多种非肌肉细胞类型中的平滑肌基因表达。肌球蛋白的同源二聚是最大转录活性所必需的，并且提供了通过结合到不同SRF结合位点的SRF肌球蛋白复合物协同激活平滑肌基因的机制。这些发现确定了肌钙蛋白是平滑肌基因表达的主要调节因子，并解释了SRF如何将平滑肌特异性传递给其靶基因。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
肌钙蛋白激活平滑肌细胞分化。(A类)肌钙蛋白转染10T1/2细胞(*a、 b、e、f*、和我–n个)或MyoD(*c、天，克*、和小时)免疫组化检测表达载体和肌肉标志物。亮场和暗场图像如所示*a、 c、e*、和克和*b、 d、f*、和小时分别是。在转染细胞的细胞核中也检测到标记有FLAG的心肌蛋白我–n个. (B类)用编码*lacZ公司*（作为阴性对照）、心肌蛋白、心肌蛋白NLSΔbasic和MyoD。蛋白质提取物用抗SM22、SM-γ-肌动蛋白和SM肌球蛋白轻链激酶抗体进行Western blot分析。α-管蛋白被检测为负荷对照。(C类和D类)10T1/2电池(C类)和NIH 3T3或3T3-L1细胞(D类)用每个通道上方所示的表达载体进行转染。分离RNA并通过RT-PCR检测肌肉基因表达。L7作为负荷控制进行测量。(E类)原代大鼠心脏成纤维细胞感染编码腺病毒*lacZ公司*或心肌肌钙蛋白染色，观察SM-α-肌动蛋白的表达。Ad仅出现背景染色-*lacZ公司*而Ad-myocardin可观察到染色强烈的细胞。这些细胞的组织也可以在低倍镜下看到(赖特). (右上)相位对比图像。（棒材，200μm）

**图2。**
心肌蛋白突变体分析。(A类)平滑肌基因表达所需的心肌蛋白结构域。用编码所示心肌结构的表达载体转染10T1/2细胞。值表示为具有每个突变体的SM MHC阳性细胞的数量相对于用野生型肌球蛋白表达质粒转染的培养物中的数量，其被赋予值100。(B类)肌钙蛋白和MRTF-A激活平滑肌基因表达。10T1/2细胞转染编码肌钙蛋白、MRTF-A或MRTF-B的表达载体，并对SM-MHC阳性细胞进行评分，如A类.(C类)显性负性心肌炎抑制平滑肌基因表达。PAC1和A10细胞感染编码腺病毒*lacZ公司*或心肌蛋白显性阴性突变体128–513。RT-PCR检测平滑肌基因表达。测量GAPDH作为负荷控制。

**图3。**
由线圈-线圈结构域介导的心肌蛋白均聚。(A类)心肌蛋白和心肌蛋白缺失突变体示意图。在转染COS细胞中表达带有FLAG标签和Myc-tagged心肌蛋白的缺失突变体。细胞提取物用抗FLAG抗体免疫沉淀（IP），用抗Myc抗体免疫印迹（IB）分析。显示斑点(赖特). LZ，亮氨酸拉链。(B类)显示了心肌蛋白亮氨酸拉链区的序列和亮氨酸拉链突变体（LZ-mut）中氨基酸的变化。如图所示，野生型和LZ突变型心肌细胞在COS细胞中表达，蛋白质-蛋白质相互作用通过免疫沉淀和免疫印迹检测。

**图4。**
心肌二聚体突变体的功能分析。(A类)凝胶迁移率变化测定用*在体外*翻译的SRF、心肌蛋白（WT）和心肌蛋白LZ突变体以及对应于c-福斯血清反应元件。仅显示含有移位探针的凝胶区域。(B类)将心肌蛋白表达载体、心肌蛋白LZ突变体和荧光素酶报告子瞬时转染COS细胞，并将其与SM22启动子或三个拷贝的c-福斯CArG盒，并测定荧光素酶活性。(C类)用心肌蛋白或心肌蛋白LZ突变体的表达载体转染10T1/2细胞，并对SM-MHC阳性细胞进行计分，如图2所示A类.(D类)用编码心肌蛋白或LZ突变体的表达载体转染10T1/2细胞。提取RNA并通过RT-PCR分析转录物。

**图5。**
SRF调控平滑肌基因的模型。肌卡蛋白优先激活由成对CArG盒控制的平滑肌基因。c-福斯启动子包含单个CArG盒，不能被心肌蛋白有效激活。肌球蛋白通过亮氨酸拉链（LZ）二聚可能暴露TAD，从而激活肌肉基因表达。其他启动子特异性因子（X）与SRF和心肌蛋白协同作用。

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1. Olson，E.N.（1990）《基因发展》，1454-1461。-公共医学
1. Hauschka，S.D.（1994），《肌肉学》，编辑：Engel，A.G.和Franzini-Amstrong，C.（McGraw–Hill，New York），第二版，第3-73页。
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[4] Hauschka，S.D.（1994），《肌肉学》，编辑：Engel，A.G.和Franzini-Amstrong，C.（McGraw–Hill，New York），第二版，第3-73页。

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[7] Treisman，R.（1995）EMBO J.14，4905-4913。-项目管理咨询公司-公共医学

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[9] Owens，G.K.（1995）《生理学》。第75版，487-517。-公共医学

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