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.2003年4月；23(7):2425-37.
doi:10.1128/MCB.23.7.2425-2437.2003。

肌球蛋白是调节平滑肌细胞分化的转录程序中的关键血清反应因子辅因子

Kevin L Du先生 1, 叶刘淑仪议员, 李健, 陈玛丽, 弗雷德里克·丹德雷, 余威廉, 陆敏敏, 加里·欧文斯, 迈克尔·S·帕马切克
附属公司

肌球蛋白是调节平滑肌细胞分化的转录程序中的关键血清反应因子辅因子

凯文·L·杜等。 分子细胞生物学. 2003年4月.

摘要

SAP家族转录因子心肌蛋白与血清反应因子（SRF）在功能上协同作用，在心脏发育中起重要作用。为了确定肌钙蛋白在平滑肌细胞（SMC）谱系中的功能，我们绘制了肌钙蛋白基因表达模式，并检查了SMC和胚胎干细胞（ES）中肌钙蛋白转录活性的分子机制。人和鼠心肌蛋白基因在血管和内脏SMC中的表达水平等于或超过在心脏中观察到的水平。在胚胎发育期间，肌钙蛋白基因在SMC中以精确的发育调控模式大量表达。在非SMC中，肌钙蛋白的强制表达可激活多种SMC特异性转录调控元件。相反，在SRF（-/-）ES细胞中未观察到心肌蛋白诱导的反式激活，但可以通过强制表达SRF或SRF DNA结合域来挽救。此外，显性负性心肌蛋白突变蛋白或小干扰RNA诱导的心肌蛋白敲除的表达显著降低SMCs中SM22α启动子的活性。最重要的是，肌钙蛋白的强制表达激活了未分化小鼠ES细胞中SM22α、平滑肌α-actin和calponin-h1基因的表达。综上所述，这些数据表明，心肌蛋白在调节SMC发育和分化的SRF依赖性转录程序中发挥着重要作用。

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数字

图1。
图1。
人心肌蛋白基因的一级结构和推导出的人和鼠心肌蛋白氨基酸序列的比对。（A） 人类肌球蛋白基因结构示意图。对GenBank数据库进行Blast搜索，确定了人类心肌蛋白基因。心肌蛋白基因位于人类17号染色体上，被鉴定为GenBank登录号AC005358。外显子显示为垂直框。外显子5中的起始密码子（ATG）如图所示。10 kb的比例尺显示在地图下方。（B） 推导的人和鼠心肌蛋白推导氨基酸序列的比对。推导出的小鼠心肌蛋白氨基酸序列显示在人类心肌蛋白序列的下方。保守氨基酸残基为深灰色。显示了保守的基本结构域（浅灰色框）、聚谷氨酰胺束（下划线）和SAP框（黑色框）。
图2。
图2。
肌钙蛋白基因表达的体内组织分布。（A） 肌肉细胞组织的Northern印迹分析。含有2μg聚（A）的膜+从胚胎和成人组织中分离出的每条RNA与放射性标记的人心肌蛋白cDNA探针杂交（暴露1周）。RNA标记显示在印迹的左侧（以千碱基为单位）。人心肌蛋白探针与约9.5 kb的主要mRNA物种杂交（黑箭头）。此外，还观察到四到五个额外的低丰度转录本（虚线箭头）在8.5到3.0 kb之间迁移。在心脏和平滑肌细胞组织中观察到肌球蛋白mRNA，包括主动脉、胃、膀胱、小肠、结肠和子宫。（B） 从成年人类（左侧面板）和小鼠（右侧面板）组织中分离的mRNA样本与放射性标记的人类（左侧板）和鼠（右侧板）心肌cDNA探针杂交的Northern blot分析（暴露1周）。在人和小鼠心脏和含SMC的组织中观察到肌球蛋白mRNA（黑箭头），但在其他组织中未观察到。
图3。
图3。
肌球蛋白基因在血管和内脏SMC中以发育调节的方式表达。原位杂交分析是在分期的CD-1小鼠胚胎上进行的35S标记心肌反义探针。（A） 在E9.5胚胎的矢状切面上，观察到心肌核糖探针（白色信号）与心室室（V）、共同心房（A）和鳃弓动脉（BA）的杂交。在E9.5时，在背主动脉（Ao）中未检测到心肌素mRNA。放大倍数，×5。（B） 在E10.5胚胎的横切面上，观察到心肌核糖探针与心室（V）、心房（A）和心脏流出道的杂交。在第三鳃弓动脉（BA）与主动脉（Ao）连接处附近也观察到高于背景水平的微弱信号。放大倍数，×5。（C） 在E11.5胚胎胸腔的矢状切面上，观察到心肌核糖探针与心室（V）、心房、心脏流出道（OFT）、肺芽的原始支气管（Br）、总主静脉（CV）和背主动脉（Ao）的杂交。放大倍数，×12.5。（D） 在E12.5胚胎胸腔和腹部的矢状切面上，观察到心肌核糖探针与心室（V）、心房（A）、支气管（Br）、肺芽、主动脉（Ao）、胃（St）和肠（Int）的杂交。放大倍数，×12.5。（E） 在E14.5胚胎的胸腔和腹部的矢状切面中，观察到肌苷核糖探针与心室（V）、心房（A）、主动脉（Ao）、食道（Eso）和肠道（Int）的杂交。在此阶段还观察到核糖探针与泌尿生殖嵴的强烈杂交（未显示）。放大倍数，×5。（F） 在E16.5胚胎腹部的矢状切面上，观察到心肌蛋白核糖探针与小肠（Int）、直肠（R）和膀胱肌壁（Bl）的杂交。放大倍数，×5。未观察到对照感觉心肌核糖探针的杂交。
图4。
图4。
心肌素诱导COS-7和未分化小鼠ES细胞中多个SMC特异性转录调控元件的反式激活。（A）顺式-在COS-7细胞中调节心肌蛋白诱导的SM22α启动子反式激活的作用机制。图中显示了SME-4（bp−171至−136）和SME-4缺失突变体CArG（bp-150至−141）、5′CArG的核苷酸序列（bp-171至−14.1）和3′CArG-（bp-151至−137）。用pcDNA-Myocardin表达质粒、phRL-TK（-Int）参考质粒和指示的报告质粒共同转染COS-7细胞。转染48小时后测定荧光素酶活性。肌卡介导的荧光素酶报告质粒转录激活置于441-bp小鼠SM22α启动子（−441.luc）的转录控制下，该启动子包含消除SRF结合的突变（−44 1μCArG.luc），与SME-4（SME4×4.luc）四个拷贝相连的90-bp SM22α启动子，连接到四个拷贝的CArG寡核苷酸（CarGx4.luc）的90bp SM22α启动子，连接到四个拷贝的5′CArG寡核苷酸（5′CarGx4.luc）的90bp SM22α启动子，以及连接到四个拷贝的3′CArG寡核苷酸（3′CarGx4.luc）的90bp SM22α启动子。荧光素酶活性是指当每个报告质粒与pcDNA-Myocardin共转染时，相对于与pcDNA3所观察到的活性，观察到的荧光素酶活性的诱导。结果表示为平均值±SEM。（B）肌球蛋白诱导小鼠ES细胞中多种SMC特异性转录调控元件的反式激活。未分化的小鼠ES细胞与pcDNA-Myocardin表达质粒、phRL-TK（-Int）参考质粒和指示的报告质粒共转染。受441-bp小鼠SM22α启动子（−441.luc）、SM-α-actin启动子和基因内增强子（pPIAct-luc）以及SM-MyHC启动子和遗传内增强器（pPIMyo-luc）转录控制的荧光素酶报告质粒的肌球蛋白诱导转录激活据报道，与pcDNA-Myocardin共转染时观察到的荧光素酶活性诱导与pcDNA3观察到的活性相关。结果表示为平均值±SEM。所有转染至少重复三次以确保再现性。
图5：。
图5：。
肌球蛋白诱导的胚胎干细胞反式激活是SRF依赖性的。（A） SRF基因靶向策略示意图。（顶部）小鼠SRF基因组基因座的部分限制性内切酶图谱，显示不是I（N），Hin公司dIII（H3），巴姆HI（B），和生态RI（R1）站点。外显子显示为黑色。MADS盒域（MADS）编码于外显子1和2。显示了Southern blot分析中使用的探针的位置。（中间）SRF靶向载体，包含PGK启动子控制下的新霉素耐药（NEO）和单纯疱疹病毒胸苷激酶（TK）基因。（底部）目标突变SRF等位基因的结构。（B） 肌卡介导的野生型和SRF反式激活−/−ES细胞。野生型SRF+/+（黑条）和纯合SRF−/−（灰条）ES细胞与−441.SM22.luc报告质粒和指定数量（微克）的心肌蛋白、SRF、SRFΔC和SRF DB表达质粒瞬时共转染。据报道，与pcDNA-Myocardin共转染时观察到的荧光素酶活性诱导数据与pcDNA3获得的荧光素酶活性诱导相关。结果表示为平均值±SEM。所有转染至少重复三次以确保再现性。
图6。
图6。
SM22α启动子活性在SMCs中是心肌依赖性的。（A） 显性负性心肌炎抑制原代大鼠主动脉平滑肌细胞SM22α启动子活性。将原代大鼠主动脉平滑肌细胞与pGL2-Control质粒（第7至12道）或−441SM22.luc（第1至6道）报告质粒和pcDNA-Δ585表达质粒的指示量（以毫微克计）瞬时共转染，编码显性阴性心肌蛋白突变蛋白。荧光素酶活性表示为当SMCs与pcDNA-Δ585表达质粒共转染时观察到的荧光素酶活性百分比，与单独转染−441SM22.luc（1到6道）或单独转染pGL2-Control（7到12道）时观察到者相比。数据表示为平均值±SEM。（B）siRNA-介导的心肌炎敲除降低A7r5 SMC中SM22α启动子的活性。将A7r5 SMCs置于含有指定浓度的心肌细胞siRNA（第2和第3道）或对照siRNA的培养基中（第4和第5道），并转染2μg−441SM22.luc（−441.luc）报告质粒。转染后48小时收集细胞，计算荧光素酶活性。数据表示为归一化相对光单位（RLU）±SEM。转染至少重复三次以确保再现性。
图7。
图7。
在未分化的小鼠ES细胞中，强制表达心肌蛋白可诱导内源性SMC基因的表达。（A） 肌钙蛋白在SM22α中的强制表达+/lacZ公司ES细胞诱导内源性SM22α基因的转录。SM22α+/lacZ公司用pcDNA3控制质粒（上面板）或pcDNA-Myocardin表达质粒（下面板）转染ES细胞。转染后48小时，细胞固定并染色以检测β-半乳糖苷酶活性。转染pcDNA3的细胞中未观察到β-半乳糖苷酶活性（蓝色染色）。相反，在SM22α+/lacZ公司转染pcDNA-Myocardin的ES细胞。（B） 肌球蛋白诱导的未分化ES细胞SMC基因表达是SRF依赖性的。战略参考框架−/−将对照质粒pcDNA3或编码心肌蛋白、SRF或心肌蛋白和SRF的表达质粒瞬时转染ES细胞。在转染后48小时，收集细胞并制备RNA。采用Applied Biosystems SYBR Green PCR Master Mix和MJ Research DNA Engine Opticon 2实时检测系统进行定量实时PCR。所有RT-PCR重复进行，有（+）和无（−）RT对照。设计引物对定量扩增小鼠心肌蛋白、SM22α、SM-α-actin、calponin-h1、，
图7。
图7。
在未分化的小鼠ES细胞中，强制表达心肌蛋白可诱导内源性SMC基因的表达。（A） 肌钙蛋白在SM22α中的强制表达+/lacZ公司ES细胞诱导内源性SM22α基因的转录。SM22α+/lacZ公司用pcDNA3控制质粒（上面板）或pcDNA-Myocardin表达质粒（下面板）转染ES细胞。转染后48小时，细胞固定并染色以检测β-半乳糖苷酶活性。转染pcDNA3的细胞中未观察到β-半乳糖苷酶活性（蓝色染色）。相反，在SM22α+/lacZ公司转染pcDNA-Myocardin的ES细胞。（B） 肌球蛋白诱导的未分化ES细胞SMC基因表达是SRF依赖性的。战略参考框架−/−将对照质粒pcDNA3或编码心肌蛋白、SRF或心肌蛋白和SRF的表达质粒瞬时转染ES细胞。在转染后48小时，收集细胞并制备RNA。采用Applied Biosystems SYBR Green PCR Master Mix和MJ Research DNA Engine Opticon 2实时检测系统进行定量实时PCR。所有RT-PCR重复进行，有（+）和无（−）RT对照。设计引物对定量扩增小鼠心肌蛋白、SM22α、SM-α-actin、calponin-h1、，
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