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.2003年3月；23(6):2055-67.
doi:10.1128/MCB.23.6.2055-2067.2003。

TRAP/介体和SWI/SNF复合物在卡波西肉瘤相关疱疹病毒RTA介导的溶血再激活中的主要作用

优桑·格瓦克 1, 华金贝克, 中村弘之, 孙华利, 迈克尔·梅斯特伦斯特, 罗伯特·G·罗德, Jae U Jung先生
附属公司

TRAP/介体和SWI/SNF复合物在卡波西肉瘤相关疱疹病毒RTA介导的溶血再激活中的主要作用

优桑·格瓦克等。 分子细胞生物学. 2003年3月.

摘要

疱疹病毒生命周期中的一个重要步骤是从潜伏期转换到溶血再激活。卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）的RTA转录激活物作为裂解再激活的分子开关。在这里，我们证明KSHV RTA通过与羧基区域中的短酸性序列的相互作用，将CBP、SWI/SNF染色质重塑复合物和TRAP/介体辅激活物招募到病毒启动子中，并且这种招募对于依赖RTA的病毒基因表达至关重要。SWI/SNF的Brg1亚基和TRAP/Mediator的TRAP230亚基被证明与RTA直接相互作用。因此，这些相互作用的基因消融消除了KSHV裂解复制。这些结果表明，通过RTA招募CBP、SWI/SNF和TRAP/介体复合物是直接调控病毒基因表达，从而使病毒裂解重新激活的主要机制。

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数字

图1。
图1。
RTA结合蛋白的纯化和鉴定。（A） RTA结合蛋白的鉴定。将含有5μg GST、GST-RTA（N1-300）或GST-RTA（C581-691）融合蛋白的谷胱甘肽-琼脂糖珠与35S标记的Raji B细胞。RTA-结合蛋白在SDS-PAGE中进行解析，并用荧光成像仪进行放射自显影。星号表示未通过质谱法鉴定的蛋白质。尺寸以千道尔顿为单位。（B） RTA-结合蛋白的质谱分析。通过质谱分析分离出的每种蛋白质的肽序列及其公布的氨基酸序列号。括号中的数字表示从质谱分析中识别特定肽序列的频率。
图2。
图2。
RTA和细胞转录辅因子之间的相互作用。（A） RTA和细胞转录辅因子之间的体外相互作用。Raji B细胞的裂解液与GST和GST-RTA（C581-691）混合或用于免疫沉淀（IP），带有图右侧所示的细胞转录辅因子抗体。GST融合复合物和免疫沉淀复合物中存在的多肽通过SDS-PAGE分离，然后用相同的抗体进行免疫印迹分析。（B） RTA和细胞转录辅因子之间的相互作用。[35S] 用转染EBG或EBG-RTA载体的蛋氨酸/半胱氨酸标记的293T细胞进行谷胱甘肽-脑葡萄糖亲和层析（树脂）。结合的GST融合复合物通过SDS-PAGE分离，然后进行放射自显影（左侧面板）。括号表示GST-RTA蛋白，星号表示与GST-RTA相关的蛋白。裂解液还用于谷胱甘肽-脑葡萄糖亲和层析或免疫沉淀，如图右侧所示，具有细胞转录辅因子抗体。GST融合和免疫沉淀复合物中存在的多肽通过SDS-PAGE分离，随后用相同的抗体进行免疫印迹分析（右图）。根据GST-RTA下拉法和免疫沉淀法的比较，GST-RTA蛋白共纯化了12.5%的Brg1、7.2%的BAF170、5.4%的BAF55、4%的TRAP220、4.1%的PCQAP、7.3%的TRAP和70%的TRAP95。
图3。
图3。
识别与细胞转录辅因子相互作用所需的RTA区域及其在RTA介导的转录激活中的作用。（A） RTA突变体的示意图。RTA包含一个N末端基本结构域、一个内部亮氨酸拉链（LZ）基序和一个C末端转录激活结构域（TAD）。文本中详细描述了每个RTA突变。（B） γ-2疱疹病毒RTA同源物羧基转录激活域中的保守序列。星号表示突变的保守氨基酸序列。（C） RTA羧基活化域的保守序列是与细胞转录辅因子相互作用所必需的。[35S] 蛋氨酸/半胱氨酸标记的Raji B细胞与GST、GST-RTA和GST-RTA突变体混合。35通过SDS-PAGE分离与GST融合蛋白相关的S标记多肽，然后进行放射自显影。该试验中使用了相同数量的每个GST融合蛋白（底部面板）。星号表示与GST-RTA融合蛋白相关的细胞蛋白。（D） RTA羧基末端区域的保守序列是RTA（Rp）和ORF57（Mp）启动子高效转录激活所必需的。将含有RTA或其突变体之一的表达载体与Rp-荧光素酶（开放矩形）或Mp-荧光素酶（实心矩形）报告子一起转染293T细胞。将RSV-β-半乳糖苷酶载体作为转染对照。在转染后48小时测量荧光素酶活性，并用β-半乳糖苷酶活性标准化荧光素酶值。荧光素酶活性表示为三个独立实验的平均值。误差条表示标准误差。显示了RTA及其突变体的表达水平（下图）。
图4。
图4。
RTA复合物中的ATP酶活性和Brg1在RTA介导的转录激活中的作用。（A） RTA复合物中存在ATP酶活性。Raji B细胞裂解物与GST或GST-RTA（C581-691）混合。在大量洗涤后，GST和GST-RTA（C581-691）复合物用于在存在或不存在20 nM质粒DNA的情况下进行ATP水解。在聚乙烯亚胺-纤维素薄层色谱板上分离每个时间点的反应，并用磷成像仪定量无机磷酸盐与ATP的比率。（B） RTA与Brg1羧基区的相互作用。GST-Brg1融合蛋白包含顶部面板中所示的Brg1的每个域。[35S] 将体外翻译的蛋氨酸标记RTA和荧光素酶蛋白与GST或GST-Brg1融合蛋白混合。经过大量清洗，35用SDS-PAGE分离与GST或GST-Brg1融合蛋白相关的S标记多肽，然后进行放射自显影。通道1表示用于结合分析的10%RTA或荧光素酶蛋白输入量。（C） Brg1在RTA介导的转录激活中的作用。如下图所示，用表达载体和报告载体转染SW13细胞。在转染后48小时测量荧光素酶活性，并用β-半乳糖苷酶活性标准化荧光素酶值。荧光素酶活性表示为三个独立实验的平均值。误差条表示标准误差。
图5：。
图5：。
RTA与TRAP/介体复合物的相互作用。（A） TRAP/介体在体外RTA介导的转录中的重要作用。每个体外转录反应混合物含有20μg核提取物（1号和2号通道，未经处理；3号和4号通道，抗TRAP25抗体缺失核提取物[ΔMED]）。使用Gal4-RTA（C581-691）蛋白作为激活剂，并添加50 ng pG5HML模板作为模板。通过荧光成像仪分析确定的相对转录（Txn）水平显示出来。（B） 当与TRAP/介体复合物结合时，RTA直接与TRAP230亚单位相互作用。将1毫升HeLa核提取物与10μg GST或GST-RTA（C581-691）在4°C下孵育7小时，并用磷酸盐缓冲盐水清洗。在室温下，将结合蛋白暴露于二甲基亚砜或二甲基亚磺酸盐中增加量的交联剂DSP中仅10分钟。通道1，核提取物（NE，初始核提取物的5%）；通道2和通道4，分别在DSP处理前对GST和GST-RTA进行亲和纯化；通道3和7，0.32 mM DSP；通道5，0.02 mM DSP；通道6，0.08 mM DSP。通过添加Tris（pH 7.5）将交联试剂淬灭至最终浓度为50 mM。用8 M尿素（3、5、6和7道）充分洗涤后，用TRAP230、TRAP95、TRAP80、MED6、TRAP25和SRB7亚单位特异性抗体对GST和GST-RTA（C581-691）复合体中的多肽进行免疫印迹分析。（C） RTA与TRAP230的相互作用。[35S] 来自体外翻译反应的蛋氨酸标记的TRAP230、TRAP230N、TRAP2300C1、TRAP230 C2、TRAP100、TRAP80和PCQAP蛋白与GST（通道2）、GST-RTA（通道3）或GST-RTA（通道4）混合。用裂解缓冲液进行大量清洗后，35通过SDS-PAGE和放射自显影分离与GST融合蛋白相关的S标记多肽。通道1表示用于结合分析的每个蛋白质输入量的10%。
图6。
图6。
向RTA依赖性启动子招募细胞转录辅因子。（A） RTA依赖和RTA非依赖启动子的染色质免疫沉淀分析。未经治疗或每毫升1μg强力霉素治疗24小时后收集KSHV感染的TRExBCBL1-RTA细胞或TRExBCBIL-RTA（ΔDD-ILQ）细胞（底部两个面板）。使用顶部显示的蛋白抗体进行染色质免疫沉淀分析。每个病毒启动子对应的PCR产物由等分（1/10）的总免疫沉淀物质（输入）生成。（B） ReChip分析。用每毫升1μg多西环素刺激TRExBCBL1-RTA细胞24小时，并进行上述染色质免疫沉淀分析。从左侧面板所示的初级免疫沉淀液中洗涤蛋白G-脑糖苷微球后，通过在37°C下用10 mM二硫苏糖醇孵育30分钟洗脱复合物，并稀释至原始体积的40倍。用图顶部所示的第二抗体重新沉淀洗脱液，然后进行PCR扩增。PCR产物来自等分（1/10）的总免疫沉淀物质（输入）。（C） 染色质免疫沉淀分析的时间进程。用强力霉素刺激TRExBCBL1-RTA细胞1、3、6、12和24小时，然后用于染色质免疫沉淀分析，如上所述。PCR产物来自等分（1/10）的总免疫沉淀物质（输入）。
图7。
图7。
RTA-介导的KSHV裂解再激活需要招募TRAP/介导物和SWI/SNF复合物。（A） RTA及其突变体激活KSHV RTA、ORF57和vIRF1基因表达。在强力霉素治疗0、6和12 h后，从KSHV感染的TRExBCBL1-cDNA5、TRExBCBL1-RTA、TREx BCBL1-RT AΔAD和TREx BC BL1-RTA（ΔDD-ILQ）细胞中提取RNA，并用32P-标记的核糖探针模板。用5%PAGE分离受保护的RNA片段，并用荧光成像仪进行可视化。（B） KSHV裂解活化水平。在用（红色）或不使用（蓝色）多西环素刺激三天后，细胞[TRExBCBL1-cDNA5、TRExBC BL1-RTA、TREx BCBL1-RTAΔAD和TREx BC BL1-RT A（ΔDD-ILQ）]用多聚甲醛固定，并与K8.1兔血清反应，然后用异硫氰酸荧光素结合的抗兔免疫球蛋白二级抗体。方框中的蓝色数字和红色数字分别表示有刺激和无刺激的K8.1阳性细胞的百分比。数据在三个独立的实验中重现。（C） 等量的RTA及其突变蛋白。用强力霉素刺激三天后，用抗Myc抗体对细胞裂解物进行免疫印迹，以检测Myc标记的RTA蛋白。
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